【摘要】：目的:泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis,AE)類似侵襲性生長的“肝癌”。目前大量的研究工作表明,宿主的免疫狀態(tài)是影響多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,E.m)感染寄生、病灶活性及疾病轉歸的重要因素。本研究旨在探討免疫抑制性分子TIGIT和PD-1介導肝AE患者T細胞免疫耗竭的機制。方法:第一部分,1.利用26例AE患者肝臟手術標本,病理切片觀察肝臟病灶周圍“活躍浸潤增殖區(qū)-炎癥微環(huán)境”形成,以及炎性細胞浸潤和肝臟病理表現(xiàn);利用Masson染色和免疫組織化學檢測AE患者肝臟纖維化程度和肝星狀細胞的活化,實時熒光定量驗證α-SMA、COL1A1和COL3A1的表達變化;免疫熒光技術鑒定肝臟病灶周圍“炎癥微環(huán)境”募集的關鍵免疫細胞亞群;血清學測定肝損傷特異性指標ALT和AST。2.利用6例AE患者肝臟手術標本,通過高通量技術篩選肝臟區(qū)域關鍵免疫抑制性分子表達變化;實時熒光定量驗證篩選的部分差異表達基因,分析免疫抑制性分子與T淋巴細胞表面特異性標記分子、抑制性炎性因子的相關性。第二部分,1.利用20例AE患者肝臟手術標本,膠原酶消化分離肝臟淋巴細胞,流式細胞術檢測病灶近旁肝臟組織與遠端肝臟組織T細胞的比例,及其表面TIGIT和PD-1表達變化,分析其比例變化與AE患者病灶活性的關系;利用免疫熒光技術等技術檢測TIGIT和PD-1免疫定位和共定位,及其配體CD155和PD-L1的細胞定位;利用體外細胞刺激實驗,流式細胞術檢測近旁肝臟組織TIGIT或PD-1陽性群T細胞與陰性群T細胞分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異變化。2.利用45例AE患者和健康志愿者外周血標本,密度梯度離心分離淋巴細胞,流式細胞術檢測T細胞的比例及其表面TIGIT和PD-1表達變化,分析與AE患者病灶活性關系;分析T細胞表面TIGIT和PD-1表達與血清蟲體特異性抗體Em2水平相關性;利用體外細胞刺激實驗,流式細胞術檢測AE患者外周血TIGIT或PD-1陽性群T細胞與陰性群T細胞增殖能力的變化,及其分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異;進一步通過TIGIT和PD-1抗體封閉,檢測T細胞增殖能力的變化。第三部分(1)建立低(50,250 PSCs)、中(500 PSCs)、高(1000,2000 PSCs)三種不同劑量泡球蚴經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型,大體觀察和分析不同劑量小鼠模型肝臟表面病灶的大小和數(shù)量;病理切片觀察肝臟免疫病理變化、微觀病灶數(shù)量、肉芽腫反應類型;天狼星紅染色和免疫組織化學檢測肝纖維化程度和肝星狀細胞的活化,實時熒光定量驗證α-sma和col1a1的表達變化。2.分離肝臟單個核細胞,流式細胞術檢測不同淋巴細胞絕對數(shù),t淋巴細胞表型變化(cd69,cd44和cd62l),以及不同t細胞亞群(t1、t2、t17和treg型)比例變化;實時熒光定量檢測肝臟組織t細胞亞群相關細胞因子的表達變化。3.通過不同劑量e.m感染小鼠模型,流式細胞術檢測肝臟區(qū)域和脾臟t細胞表面tigit和pd-1表達變化,以及共表達情況;利用體外細胞刺激實驗,流式細胞術檢測tigit或pd-1陽性群t細胞與陰性群t細胞分泌granzymeb、cd107a、ifn-γ和tnf-α的差異變化。結果:第一部分,1.ae患者肝臟病灶周圍形成“炎癥微環(huán)境”,主要以cd8~+t淋巴細胞浸潤為主炎性細胞帶,伴隨cd4~+t淋巴細胞、巨噬細胞和成纖維細胞浸潤。2.基因芯片高通量篩選,發(fā)現(xiàn)ae患者肝臟病灶周圍免疫反應相關趨化因子(ccl3、ccl8、ccl17、ccl18、ccl19、ccl21、ccl26)、淋巴細胞表面分子(cd69、cd44、cd1e、cd8b、cd27)、免疫抑制性分子(ctla4、crtam、btla、tigit)和炎性細胞因子(il-10、ifn-γ、ido1)等呈上調表達,其中tigit、il-10和ifn-γ基因的上調倍數(shù)分別為2.07、3.72和3.19;通過實時熒光定量驗證和相關性分析顯示,tigit和pd-1分子分別與cd4(tigit,r=0.3083,p=0.1524;pd-1,r=0.4749,p=0.0255)、cd8(tigit,r=0.6631,p=0.0003;pd-1,r=0.6652,p=0.0004),以及抑制性炎性細胞因子il-10(tigit,r=0.7938,p0.0001;pd-1,r=0.4980,p=0.0156)呈正相關性,tigit和pd-1也呈正相關性(r=0.7304,p0.0001)。第二部分,1.ae患者肝臟區(qū)域tigit和pd-1單獨或協(xié)同性表達于cd4~+t和cd8~+t細胞表面,導致肝臟局部cd4~+t和cd8~+t細胞分泌效應分子granzymeb(cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:8.00±3.03%vs32.0±8.32%,p0.05)、細胞因子ifn-γ(cd4~+tigit+vscd4~+tigit-:8.18±2.65%vs17.8±3.95%,p0.05)、細胞因子tnf-α(cd8~+tigit+vscd8~+tigit-:9.67±2.56%vs18.9±3.92%,p0.001;cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:7.22±2.71%vs24.7±4.48%,p0.01)能力降低。2.ae患者肝臟病灶周圍肝細胞為cd4~+t和cd8~+t細胞表面tigit提供配體cd155,巨噬細胞表面pd-1提供配體pd-l1。3.ae患者外周血cd8~+t細胞顯著增加(p0.01),tigit和pd-1分子單獨或協(xié)同性表達于cd4~+t和cd8~+t細胞表面(cd8~+tigit+tcells,hlvsae:34.3±2.40%vs48.9±2.62%,p0.001;cd8~+pd-1+tcells,hlvsae:18.6±1.39%vs23.3±1.64%,p0.05),其中pd-1陽性cd4~+t或cd8~+t細胞比例增加伴隨ae患者血清中抗em2抗體水平增加(cd4~+pd-1+tcellss,em2,+vs++vs+++:3.41±0.70%vs6.91±1.00%vs6.91±1.00%,p0.05);ae患者外周tigit或pd-1陽性群t細胞與陰性群t細胞相比,其分泌granzymeb、perforin、ifn-γ和tnf-α能力降低,其中CD8+T細胞TIGIT陽性細胞群增殖能力顯著下降(CD8+TIGIT+vs CD8+TIGIT-:38.7%vs 67.7%,P0.05);通過TIGIT抗體封閉,能夠促進CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖。4.依據(jù)PET/CT影像學分組,高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+T細胞呈TIGIT和PD-1上調表達(肝臟,高vs低活躍型:TIGIT,31.7±9.09%vs26.4±11.0%;PD-1,19.8±8.57%vs 12.1±2.08%,P0.05.外周血,高vs低活躍型:51.6±14.7%vs 38.2±15.1%,P0.05;PD-1,22.1±11.7%vs 15.9±10.0%,P0.05)。第三部分,1.成功建立了E.m經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型,低和中劑量感染早期,肝臟局部形成T1型(CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+)和T17型細胞亞群優(yōu)勢,促進宿主對低中劑量E.m感染的清除;而高劑量感染晚期,肝臟局部形成以CD8+T細胞占優(yōu)勢 炎癥微環(huán)境‖,肝臟局部形成T2型和T17型細胞亞群優(yōu)勢,并且Treg型(CD4+IL-10+和CD8+IL-10+)細胞亞群比例趨于上調趨勢,促進高劑量E.m感染在宿主肝臟的慢性寄生。2.高劑量E.m感染中晚期,誘導肝臟局部CD4+T細胞表面TIGIT和PD-1分子單獨或協(xié)同性表達上調(P0.05或P0.001),CD8+T細胞表面TIGIT分子表達上調(24周,CD8+TIGIT+T cells,對照vs低vs周vs高劑量組:8.91±2.29%vs 12.3±1.45%vs 8.90±0.99%vs 15.5±2.15%,P0.05),其中TIGIT或PD-1陽性CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。3.不同劑量E.m感染中晚期,脾臟CD4+T細胞表面TIGIT和PD-1分子單獨或協(xié)同性表達上調(24周,CD4+TIGIT+T cells,對照vs低vs周vs高劑量組:15.7±2.54%vs 28.8±2.10%vs 27.6±3.46%vs 28.0±2.82%,P0.05;CD4+PD-1+T cells,對照vs低vs周vs高劑量組:28.2±4.20%vs 42.6±2.59%vs 45.6±5.25%vs39.7±2.41%,P0.05),TIGIT或PD-1陽性CD4+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α能力下降,TIGIT或PD-1陽性CD8+T細胞分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。結論:1.AE患者肝臟區(qū)域存在“炎癥微環(huán)境”,形成以CD8+T細胞浸潤為主炎性細胞帶,周圍肝細胞提供配體CD155與TIGIT相互作用,巨噬細胞提供配體PD-L1與PD-1相互作用,可能以CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1結合模式介導抑制性信號傳遞,導致肝臟局部T細胞功能降低,促進T細胞耗竭。2.高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+T細胞表面TIGIT和PD-1分子協(xié)同性上調表達,造成效應性T細胞功能下降,促進E.m活躍性或侵襲性生長。利用TIGIT抗體封閉,能夠促進T細胞增殖能力。3.成功建立不同劑量E.m經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型;不同T1、T2、T17和Treg型亞群的免疫失衡,以及肝臟局部和脾臟T細胞表面TIGIT或PD-1分子表達上調,導致T細胞功能耗竭,造成高劑量E.m感染在宿主肝臟的慢性寄生,加重肝臟病理性損傷和纖維化程度。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R532.32

【共引文獻】

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本文編號：2287090