發(fā)布時(shí)間：2018-10-22 11:56

【摘要】：目的:泡型包蟲病(Alveolar Echinococcosis,AE)類似侵襲性生長(zhǎng)的“肝癌”。目前大量的研究工作表明,宿主的免疫狀態(tài)是影響多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,E.m)感染寄生、病灶活性及疾病轉(zhuǎn)歸的重要因素。本研究旨在探討免疫抑制性分子TIGIT和PD-1介導(dǎo)肝AE患者T細(xì)胞免疫耗竭的機(jī)制。方法:第一部分,1.利用26例AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本,病理切片觀察肝臟病灶周圍“活躍浸潤(rùn)增殖區(qū)-炎癥微環(huán)境”形成,以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝臟病理表現(xiàn);利用Masson染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)AE患者肝臟纖維化程度和肝星狀細(xì)胞的活化,實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證α-SMA、COL1A1和COL3A1的表達(dá)變化;免疫熒光技術(shù)鑒定肝臟病灶周圍“炎癥微環(huán)境”募集的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群;血清學(xué)測(cè)定肝損傷特異性指標(biāo)ALT和AST。2.利用6例AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本,通過(guò)高通量技術(shù)篩選肝臟區(qū)域關(guān)鍵免疫抑制性分子表達(dá)變化;實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證篩選的部分差異表達(dá)基因,分析免疫抑制性分子與T淋巴細(xì)胞表面特異性標(biāo)記分子、抑制性炎性因子的相關(guān)性。第二部分,1.利用20例AE患者肝臟手術(shù)標(biāo)本,膠原酶消化分離肝臟淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病灶近旁肝臟組織與遠(yuǎn)端肝臟組織T細(xì)胞的比例,及其表面TIGIT和PD-1表達(dá)變化,分析其比例變化與AE患者病灶活性的關(guān)系;利用免疫熒光技術(shù)等技術(shù)檢測(cè)TIGIT和PD-1免疫定位和共定位,及其配體CD155和PD-L1的細(xì)胞定位;利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)近旁肝臟組織TIGIT或PD-1陽(yáng)性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異變化。2.利用45例AE患者和健康志愿者外周血標(biāo)本,密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的比例及其表面TIGIT和PD-1表達(dá)變化,分析與AE患者病灶活性關(guān)系;分析T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1表達(dá)與血清蟲體特異性抗體Em2水平相關(guān)性;利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AE患者外周血TIGIT或PD-1陽(yáng)性群T細(xì)胞與陰性群T細(xì)胞增殖能力的變化,及其分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差異;進(jìn)一步通過(guò)TIGIT和PD-1抗體封閉,檢測(cè)T細(xì)胞增殖能力的變化。第三部分(1)建立低(50,250 PSCs)、中(500 PSCs)、高(1000,2000 PSCs)三種不同劑量泡球蚴經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型,大體觀察和分析不同劑量小鼠模型肝臟表面病灶的大小和數(shù)量;病理切片觀察肝臟免疫病理變化、微觀病灶數(shù)量、肉芽腫反應(yīng)類型;天狼星紅染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝纖維化程度和肝星狀細(xì)胞的活化,實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證α-sma和col1a1的表達(dá)變化。2.分離肝臟單個(gè)核細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù),t淋巴細(xì)胞表型變化(cd69,cd44和cd62l),以及不同t細(xì)胞亞群(t1、t2、t17和treg型)比例變化;實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)肝臟組織t細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化。3.通過(guò)不同劑量e.m感染小鼠模型,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟區(qū)域和脾臟t細(xì)胞表面tigit和pd-1表達(dá)變化,以及共表達(dá)情況;利用體外細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)tigit或pd-1陽(yáng)性群t細(xì)胞與陰性群t細(xì)胞分泌granzymeb、cd107a、ifn-γ和tnf-α的差異變化。結(jié)果:第一部分,1.ae患者肝臟病灶周圍形成“炎癥微環(huán)境”,主要以cd8~+t淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎性細(xì)胞帶,伴隨cd4~+t淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)。2.基因芯片高通量篩選,發(fā)現(xiàn)ae患者肝臟病灶周圍免疫反應(yīng)相關(guān)趨化因子(ccl3、ccl8、ccl17、ccl18、ccl19、ccl21、ccl26)、淋巴細(xì)胞表面分子(cd69、cd44、cd1e、cd8b、cd27)、免疫抑制性分子(ctla4、crtam、btla、tigit)和炎性細(xì)胞因子(il-10、ifn-γ、ido1)等呈上調(diào)表達(dá),其中tigit、il-10和ifn-γ基因的上調(diào)倍數(shù)分別為2.07、3.72和3.19;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證和相關(guān)性分析顯示,tigit和pd-1分子分別與cd4(tigit,r=0.3083,p=0.1524;pd-1,r=0.4749,p=0.0255)、cd8(tigit,r=0.6631,p=0.0003;pd-1,r=0.6652,p=0.0004),以及抑制性炎性細(xì)胞因子il-10(tigit,r=0.7938,p0.0001;pd-1,r=0.4980,p=0.0156)呈正相關(guān)性,tigit和pd-1也呈正相關(guān)性(r=0.7304,p0.0001)。第二部分,1.ae患者肝臟區(qū)域tigit和pd-1單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)于cd4~+t和cd8~+t細(xì)胞表面,導(dǎo)致肝臟局部cd4~+t和cd8~+t細(xì)胞分泌效應(yīng)分子granzymeb(cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:8.00±3.03%vs32.0±8.32%,p0.05)、細(xì)胞因子ifn-γ(cd4~+tigit+vscd4~+tigit-:8.18±2.65%vs17.8±3.95%,p0.05)、細(xì)胞因子tnf-α(cd8~+tigit+vscd8~+tigit-:9.67±2.56%vs18.9±3.92%,p0.001;cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:7.22±2.71%vs24.7±4.48%,p0.01)能力降低。2.ae患者肝臟病灶周圍肝細(xì)胞為cd4~+t和cd8~+t細(xì)胞表面tigit提供配體cd155,巨噬細(xì)胞表面pd-1提供配體pd-l1。3.ae患者外周血cd8~+t細(xì)胞顯著增加(p0.01),tigit和pd-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)于cd4~+t和cd8~+t細(xì)胞表面(cd8~+tigit+tcells,hlvsae:34.3±2.40%vs48.9±2.62%,p0.001;cd8~+pd-1+tcells,hlvsae:18.6±1.39%vs23.3±1.64%,p0.05),其中pd-1陽(yáng)性cd4~+t或cd8~+t細(xì)胞比例增加伴隨ae患者血清中抗em2抗體水平增加(cd4~+pd-1+tcellss,em2,+vs++vs+++:3.41±0.70%vs6.91±1.00%vs6.91±1.00%,p0.05);ae患者外周tigit或pd-1陽(yáng)性群t細(xì)胞與陰性群t細(xì)胞相比,其分泌granzymeb、perforin、ifn-γ和tnf-α能力降低,其中CD8+T細(xì)胞TIGIT陽(yáng)性細(xì)胞群增殖能力顯著下降(CD8+TIGIT+vs CD8+TIGIT-:38.7%vs 67.7%,P0.05);通過(guò)TIGIT抗體封閉,能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖。4.依據(jù)PET/CT影像學(xué)分組,高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+T細(xì)胞呈TIGIT和PD-1上調(diào)表達(dá)(肝臟,高vs低活躍型:TIGIT,31.7±9.09%vs26.4±11.0%;PD-1,19.8±8.57%vs 12.1±2.08%,P0.05.外周血,高vs低活躍型:51.6±14.7%vs 38.2±15.1%,P0.05;PD-1,22.1±11.7%vs 15.9±10.0%,P0.05)。第三部分,1.成功建立了E.m經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型,低和中劑量感染早期,肝臟局部形成T1型(CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+)和T17型細(xì)胞亞群優(yōu)勢(shì),促進(jìn)宿主對(duì)低中劑量E.m感染的清除;而高劑量感染晚期,肝臟局部形成以CD8+T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì) 炎癥微環(huán)境‖,肝臟局部形成T2型和T17型細(xì)胞亞群優(yōu)勢(shì),并且Treg型(CD4+IL-10+和CD8+IL-10+)細(xì)胞亞群比例趨于上調(diào)趨勢(shì),促進(jìn)高劑量E.m感染在宿主肝臟的慢性寄生。2.高劑量E.m感染中晚期,誘導(dǎo)肝臟局部CD4+T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)上調(diào)(P0.05或P0.001),CD8+T細(xì)胞表面TIGIT分子表達(dá)上調(diào)(24周,CD8+TIGIT+T cells,對(duì)照vs低vs周vs高劑量組:8.91±2.29%vs 12.3±1.45%vs 8.90±0.99%vs 15.5±2.15%,P0.05),其中TIGIT或PD-1陽(yáng)性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。3.不同劑量E.m感染中晚期,脾臟CD4+T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子單獨(dú)或協(xié)同性表達(dá)上調(diào)(24周,CD4+TIGIT+T cells,對(duì)照vs低vs周vs高劑量組:15.7±2.54%vs 28.8±2.10%vs 27.6±3.46%vs 28.0±2.82%,P0.05;CD4+PD-1+T cells,對(duì)照vs低vs周vs高劑量組:28.2±4.20%vs 42.6±2.59%vs 45.6±5.25%vs39.7±2.41%,P0.05),TIGIT或PD-1陽(yáng)性CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α能力下降,TIGIT或PD-1陽(yáng)性CD8+T細(xì)胞分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。結(jié)論:1.AE患者肝臟區(qū)域存在“炎癥微環(huán)境”,形成以CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)為主炎性細(xì)胞帶,周圍肝細(xì)胞提供配體CD155與TIGIT相互作用,巨噬細(xì)胞提供配體PD-L1與PD-1相互作用,可能以CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1結(jié)合模式介導(dǎo)抑制性信號(hào)傳遞,導(dǎo)致肝臟局部T細(xì)胞功能降低,促進(jìn)T細(xì)胞耗竭。2.高活躍型AE患者肝臟區(qū)域和外周血CD8+T細(xì)胞表面TIGIT和PD-1分子協(xié)同性上調(diào)表達(dá),造成效應(yīng)性T細(xì)胞功能下降,促進(jìn)E.m活躍性或侵襲性生長(zhǎng)。利用TIGIT抗體封閉,能夠促進(jìn)T細(xì)胞增殖能力。3.成功建立不同劑量E.m經(jīng)肝門靜脈感染小鼠模型;不同T1、T2、T17和Treg型亞群的免疫失衡,以及肝臟局部和脾臟T細(xì)胞表面TIGIT或PD-1分子表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭,造成高劑量E.m感染在宿主肝臟的慢性寄生,加重肝臟病理性損傷和纖維化程度。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R532.32

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2287090