【摘要】：背景瘢痕疙瘩是一種病理性瘢痕,生物學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積,成纖維細(xì)胞增殖活躍。其發(fā)病機(jī)制未完全明確,目前缺乏有效的診斷、治療和復(fù)發(fā)監(jiān)測手段[1,21。瘢痕疙瘩具有一定的家族聚集性和遺傳性,針對瘢痕疙瘩家系的研究表明其患病常為多發(fā),不同家系臨床表現(xiàn)不盡相同,推測家族聚集性瘢痕疙瘩和散發(fā)性瘢痕疙瘩可能有不同的蛋白表達(dá)譜及表達(dá)特征。瘢痕疙瘩與增生性瘢痕相比,具有長期持續(xù)生長、超過原始損傷范圍、反復(fù)發(fā)作、不易自行消退、腫瘤異質(zhì)性及侵襲性的特點(diǎn)。但目前兩者的鑒別診斷一般還是依靠臨床表現(xiàn),對于一些不典型的瘢痕疙瘩或增生明顯,持續(xù)時間較長的增生性瘢痕,鑒別有一定的困難。由于臨床診斷也將直接影響后續(xù)治療計劃,故找出較為科學(xué)有效的鑒別方法有著重要的意義。蛋白質(zhì)是遺傳物質(zhì)發(fā)揮功能的直接載體,在疾病發(fā)生發(fā)展、機(jī)體反應(yīng)和轉(zhuǎn)歸預(yù)后的各個進(jìn)程中都發(fā)揮著重要的作用。目前針對瘢痕疙瘩蛋白表達(dá)的研究并不完善,探索其特異性標(biāo)志物及蛋白相互作用關(guān)系對疾病診斷、鑒別、復(fù)發(fā)監(jiān)測都有著重要的意義。目的獲得瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮膚大體組織及血清中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜及各組標(biāo)本之間的差異蛋白,分析其分子功能、參與的生物過程及蛋白相互作用關(guān)系,擬找到特異性蛋白標(biāo)志物,為瘢痕疙瘩發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供理論和方法學(xué)依據(jù),并能應(yīng)用于瘢痕疙瘩的診斷、與其他疾病,如處于增生期的增生性瘢痕等的鑒別,瘢痕體質(zhì)術(shù)前篩查,治療預(yù)后評估及復(fù)發(fā)檢測等方面。方法本課題研究以聚集性瘢痕疙瘩(familial keloid,FK)、散發(fā)性瘢痕疙瘩(sporadic keloid,SK)、增生性瘢痕(hypertrophy scar,HS)、正常皮膚(normalskin,NS)4組樣本大體組織和血清為研究對象,應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技術(shù)配合串聯(lián)質(zhì)譜分析,對其蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行分析和比較,獲得4組樣本組織與血清中的蛋白表達(dá)情況,及各組之間的差異蛋白種類。對組間差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,主要包括以下幾方面:基因本體論(gene ontology,GO)分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics,KEGG)數(shù)據(jù)庫通路分析、差異蛋白GO及KEGG Pathway富集分析、蛋白相鄰類的聚簇分析(ClusterofOrthologousGroupsofproteins,COG)、聚類分析、蛋白質(zhì)相互作用分析等方法。針對大體組織標(biāo)本蛋白質(zhì)組學(xué)篩選結(jié)果,挑選8個蛋白質(zhì),使用蛋白質(zhì)印跡(Western blot,WB)和免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry,IHC)進(jìn)行技術(shù)驗證,觀察其表達(dá)與iTRAQ檢測結(jié)果是否一致。將大體組織和血清蛋白組學(xué)篩選結(jié)果進(jìn)行對比分析,找出5在兩種樣本中同時存在,且表達(dá)變化較大的蛋白,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)進(jìn)行驗證。擬找到特異性蛋白標(biāo)志物,用于病理性瘢痕的診斷和鑒別。結(jié)果1、大體組織標(biāo)本蛋白質(zhì)鑒定及分析驗證結(jié)果四組大體標(biāo)本共鑒定到蛋白質(zhì)2450種,篩選出p0.05同時變化倍數(shù)在1.2倍(上下調(diào))以上的差異蛋白,情況如下:與NS相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共250種,下調(diào)281種;SK中特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共281種,下調(diào)232種;HS中特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共199種,下調(diào)233種。與SK相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共64種,下調(diào)164種;HS中特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共79種,下調(diào)169種。與HS相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)的蛋白共124種,下調(diào)115種。對鑒定到的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行GO、KEGG注釋及富集分析、聚類分析,并采用Western blot和免疫組織化學(xué)法驗證了幾種變化較明顯的蛋白的表達(dá),驗證了 iTRAQ技術(shù)的可靠性。2、血清標(biāo)本蛋白質(zhì)鑒定及分析驗證結(jié)果血清標(biāo)本鑒定到蛋白質(zhì)總數(shù)860個,篩選出p0.05同時變化倍數(shù)在1.2倍(上下調(diào))以上的差異蛋白,情況如下:與NS相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)蛋白13種,下調(diào)22種;SK中特異性表達(dá)上調(diào)蛋白28種,下調(diào)25種;HS中特異性表達(dá)上調(diào)蛋白8種,下調(diào)14種。與SK相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)蛋白16種,下調(diào)27種;與HS相比,FK特異性表達(dá)上調(diào)蛋白17種,下調(diào)蛋白5種;SK特異性表達(dá)上調(diào)蛋白24種,下調(diào)11種。對差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并與組織塊差異蛋白對比,找出變化一致的蛋白,在NCBI網(wǎng)站上獲取這些蛋白的基本信息,根據(jù)功能和細(xì)胞定位進(jìn)行初步總結(jié)分類。通過已有知識、數(shù)據(jù)庫注釋和文獻(xiàn)資料,選擇5種蛋白作為候選血清學(xué)蛋白標(biāo)志物進(jìn)行ELISA驗證。結(jié)果顯示,Fibronection在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕患者血清中的表達(dá)顯著高于正常對照組。結(jié)論本課題通過采用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行瘢痕疙瘩、增生性瘢痕與正常皮膚組織及血清標(biāo)本的檢測,獲得了4組標(biāo)本的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,明確了各組之間的差異蛋白質(zhì)表達(dá)情況,分析了蛋白種類功能、所在通路及相互作用情況,為找到特異性蛋白標(biāo)志物,揭示瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制,及臨床診斷、治療、復(fù)發(fā)檢測提供了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R622

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本文編號：2265017