【摘要】：第一部分蘇木酮A抗順鉑所致小鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制目的:順鉑(Cisplatin,CP)作為抗腫瘤常用的最有效化療藥物應(yīng)用之一,在治療的同時(shí),可產(chǎn)生腎毒性損傷,影響其臨床應(yīng)用。本部分采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn),從整體水平上觀察蘇木酮A(Sappanone A,SA)能否逆轉(zhuǎn)或改善順鉑所致腎組織毒性損傷,并通過(guò)觀察氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的變化,探討其可能的保護(hù)機(jī)制。方法:將Balb/c小鼠隨機(jī)分為5組(每組n=8只)。(1)空白對(duì)照組(Control);(2)CP組(20 mg/kg);(3)CP+SA低劑量組(10 mg/kg);(4)CP+SA中劑量組(20 mg/kg);(5)CP+SA高劑量組(40 mg/kg)。聯(lián)合用藥組提前3天給予蘇木酮A預(yù)處理,順鉑給藥后4天,處死動(dòng)物,留取血、腎標(biāo)本。生物化學(xué)方法檢測(cè)血清中BUN和Cr的含量;HE染色光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理學(xué)變化;TUNEL檢測(cè)腎組織細(xì)胞的凋亡率;生物化學(xué)方法檢測(cè)血清SOD酶活性及腎組織MDA含量;熒光定量PCR檢測(cè)腎組織中TNF-α、IL-1β、Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)。ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β蛋白水平表達(dá),Western blot法檢測(cè)腎組織中HO-1、p-p65、P65、IκB、p-IκB和Nrf2表達(dá)變化。結(jié)果:1蘇木酮A能夠改善順鉑所致的腎功能損傷:CP組小鼠血清中BUN和Cr的含量均顯著高于Control組;CP+SA各劑量組小鼠血清中BUN和Cr的含量均顯著低于CP組,呈劑量依賴性(P0.05)。2蘇木酮A能夠改善順鉑所致的腎組織損傷:CP組腎組織損傷程度嚴(yán)重,腎小管重度顆�？张葑冃�,部分腎小管刷毛緣脫落,局部胞漿崩解,小管內(nèi)可見細(xì)胞碎片;而CP+SA組小鼠的腎組織損傷較順鉑組明顯減輕,尤以高劑量組減輕明顯。3蘇木酮A能夠降低順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡:CP組小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率顯著高于Control組(P0.05);CP+SA各劑量組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率均顯著低于CP組(P0.05)。4蘇木酮a能夠緩解順鉑所致的腎組織氧化應(yīng)激水平:與control組比較,cp組小鼠腎組織中sod酶活性顯著降低(p0.05)而mda含量顯著增加;與cp組比較,cp+sa各劑量組小鼠血清中sod酶活性均明顯升高(p0.05)而腎組織中mda含量均顯著減少(p0.05),呈劑量依賴性。5蘇木酮a能夠降低順鉑所致的腎組織p-nf-κbp65的表達(dá):westernblot結(jié)果顯示:cp組小鼠腎組織中p-p65、p-iκb表達(dá)顯著高于control組(p0.05),而iκb表達(dá)下降;當(dāng)用順鉑與蘇木酮a聯(lián)合給藥后,小鼠腎組織中p-p65、p-iκb表達(dá)顯著低于cp組、iκb表達(dá)上調(diào)(p0.05),且隨著蘇木酮a濃度的增加,p-nf-κb表達(dá)逐漸降低,呈劑量依賴性。6蘇木酮a能夠降低順鉑所致的腎組織的炎癥反應(yīng):與control相比,cp組小鼠腎組織中tnf-α、il-1βmrna和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(p0.05)而nrf2、ho-1mrna和蛋白相對(duì)表達(dá)量則均顯著降低(p0.05);sa能夠逆轉(zhuǎn)cp引起的上述改變,且呈劑量依賴性。小結(jié):1蘇木酮a能夠減輕順鉑所致腎組織結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡,改善腎功能。2蘇木酮a抗順鉑導(dǎo)致的腎組織細(xì)胞毒性損傷作用可能是通過(guò)提高nrf2表達(dá),從而調(diào)控其下游相關(guān)基因而發(fā)揮抗氧化作用、抗炎癥和抗細(xì)胞凋亡作用而實(shí)現(xiàn)的。第二部分蘇木酮a抗順鉑所致hk-2細(xì)胞毒性作用及機(jī)制目的:本研究選用人腎近曲小管上皮細(xì)胞株(hk-2細(xì)胞)為研究對(duì)象,從細(xì)胞水平上探討蘇木酮a(sappanonea,sa)抗順鉑所致細(xì)胞毒性作用。方法:體外培養(yǎng)hk-2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分3組。(1)空白對(duì)照組(dmso組);(2)順鉑組(cp組,5μm);(3)蘇木酮a聯(lián)合順鉑組(5μmcp+10μmsa組、5μmcp+20μmsa組及5μmcp+30μmsa組)。于cp給藥前1小時(shí)加入sa。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;elisa法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中tnf-α、il-1β蛋白水平;生化法檢測(cè)細(xì)胞中mda、·oh蛋白含量;westernblot檢測(cè)p-p65、p65、iκb、p-iκb和nrf2蛋白表達(dá)。結(jié)果:1sa能夠逆轉(zhuǎn)cp所致的腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷mtt結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,cp對(duì)hk-2細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用,細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,增殖水平明顯下降;與cp組相比,經(jīng)sa預(yù)處理后,cp+sa組hk-2細(xì)胞的增殖水平顯著上調(diào),呈劑量依賴性。2sa預(yù)處理能夠降低cp所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與control組相比,cp組hk-2細(xì)胞凋亡率明顯增高[(38.06±2.38)%];與單用順鉑組相比,cp+sa聯(lián)合用藥組hk-2細(xì)胞凋亡百分率顯著減少[(30.65±1.21)%,(28.23±2.33)%和(20.89±3.23)%],并隨著蘇木酮a的作用濃度增加,細(xì)胞的凋亡率隨之降低(p0.05)。3sa預(yù)處理能夠降低cp所致腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子tnf-α和il-1β的釋放elisa檢測(cè)結(jié)果顯示:cp組hk-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中tnf-α和il-1β蛋白的含量明顯高于control組(p0.05);cp+10μmsa、cp+20μmsa組、cp+30μmsa各聯(lián)合給藥組hk-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中tnf-α和il-1β蛋白的含量均明顯低于cp組(p0.05),且隨著蘇木酮a濃度的增高而逐漸降低。4sa能降低cp所致hk-2細(xì)胞氧化應(yīng)激水平生化法檢測(cè)mda、·oh含量檢測(cè)結(jié)果顯示:與control組比較,cp組hk-2細(xì)胞中mda、·oh含量顯著增高(p0.05);當(dāng)用cp與sa聯(lián)合給藥后,cp+10μmsa、cp+20μmsa組、cp+30μmsa的hk-2細(xì)胞中mda、·oh含量顯著低于cp組小鼠(p0.05),且隨著sa給藥濃度的增加,mda、·oh含量逐漸降低,呈劑量依賴性5sa能夠降低cp所致的腎小管上皮細(xì)胞中p-nf-κbp65蛋白表達(dá)而上調(diào)nrf2蛋白表達(dá)水平westernblot結(jié)果顯示:與control比較,cp組hk-2細(xì)胞中p-p65和p-iκb蛋白的表達(dá)水平顯著增高(p0.05);cp+10μmsa、cp+20μmsa組、cp+30μmsa各聯(lián)合給藥組hk-2細(xì)胞中p-p65和p-iκb蛋白的表達(dá)水平顯著低于cp組(p0.05),且隨著蘇木酮a給藥濃度的增加,p-p65,p-iκb蛋白的表達(dá)水平逐漸降低,呈劑量依賴性。與control相比,cp組hk-2細(xì)胞中nrf2核蛋白相對(duì)表達(dá)量則顯著降低(p0.05);sa能夠逆轉(zhuǎn)cp引起的上述改變,且呈劑量依賴性。小結(jié):蘇木酮a具有抗順鉑所致hk-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,其作用可能與提高核蛋白nrf2的表達(dá)、降低nf-κb活化從而抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。第三部分nrf2信號(hào)通路在蘇木酮a抗順鉑所致hk-2細(xì)胞毒性中的作用目的:nrf2/are信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為人類機(jī)體內(nèi)最為重要的內(nèi)源性防御體系,在抗氧化應(yīng)激、抗炎反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡和抗組織器官損傷保護(hù)等方面發(fā)揮重要作用。本部分在前兩部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,敲低nrf2表達(dá)后,觀察sa和順鉑聯(lián)合用藥的hk-2細(xì)胞細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、nf-κb活性及il-1β釋放的變化,深入探討nrf2信號(hào)通路在sa抗cp所致腎小管上皮細(xì)胞損傷中的確切作用。方法:將含有nrf2sirna的片段克隆入慢病毒載體pglv3-gfp中,隨后將該載體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞,包裝出含有nrf2sirna的病毒并將之感染hk-2細(xì)胞,構(gòu)建nrf2沉默表達(dá)的hk-2細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為8組(n=3):(1)正常對(duì)照組(nc組);(2)cp組;(3)sa組;(4)cp+sa組;(5)nrf2sirna轉(zhuǎn)染組;(6)cp+nrf2sirna轉(zhuǎn)染組;(7)sa+nrf2sirna轉(zhuǎn)染組;(8)cp+sa+nrf2sirna轉(zhuǎn)染組。流式細(xì)胞術(shù)和tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;比色法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)(·oh、mda含量);westernblot法檢測(cè)細(xì)胞中ho-1、nrf2和p-p65蛋白表達(dá);elisa技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清中il-1β含量。結(jié)果:1下調(diào)nrf2表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)sa對(duì)抗cp致hk-2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用:流式細(xì)胞術(shù)和tunel結(jié)果顯示,cp能夠誘導(dǎo)hk-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,而sa能夠逆轉(zhuǎn)cp所致細(xì)胞凋亡,但敲低nrf2表達(dá)后sa并不能逆轉(zhuǎn)cp所致的hk-2細(xì)胞凋亡,腎小管上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高;2下調(diào)nrf2表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)sa對(duì)cp致hk-2細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的保護(hù)作用:與正常對(duì)照組相比,cp組細(xì)胞中·oh和mda含量均明顯增加(p0.05);與cp組相比,sa+cp組細(xì)胞中·oh和mda含量均明顯減少(p0.05);敲低nrf2基因的sa+cp組hk-2細(xì)胞中·oh和mda含量增加(p0.05)。3下調(diào)nrf2表達(dá)能夠降低sa和cp聯(lián)合用藥組中ho-1蛋白的表達(dá):westernblot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ho-1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:與非轉(zhuǎn)染各組(對(duì)照組)相比,敲低nrf2基因的各組hk-2細(xì)胞中ho-1的蛋白表達(dá)均明顯降低,(p0.05);尤其是與cp組相比,cp+sirna組ho-1蛋白表達(dá)顯著降低;與cp+sa組相比,cp+sa+sirna組ho-1蛋白表達(dá)更低;4下調(diào)nrf2表達(dá)能夠上調(diào)sa和cp聯(lián)合用藥組中p-nf-κbp65蛋白表達(dá):cp能夠上調(diào)hk-2細(xì)胞中p-nf-κbp65蛋白表達(dá),而sa能夠降低cp介導(dǎo)的p-nf-κbp65表達(dá);與cp+sa組相比,cp+sa+sirna組中p-nf-κbp65蛋白顯著上調(diào);5下調(diào)nrf2表達(dá)能夠上調(diào)sa和cp聯(lián)合用藥組hk-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中il-1β含量:elisa結(jié)果顯示,與cp組,cp+sirna組hk-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中il-1β含量顯著增多,cp+sa組反而降低;而與cp+sa組相比,cp+sa+sirna組hk-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中il-1β含量卻顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小結(jié):1敲低hk-2細(xì)胞中nrf2表達(dá)能夠上調(diào)hk-2細(xì)胞的凋亡率,加重cp誘導(dǎo)的hk-2細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)sa對(duì)抗cp致hk-2細(xì)胞損傷,提示sa通過(guò)激活nrf2,對(duì)抗cp所致的hk-2細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有減輕細(xì)胞毒性的作用。2敲低nrf2蛋白后,ho-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低,提示sa減輕cp細(xì)胞毒性作用可能通過(guò)上調(diào)nrf2蛋白表達(dá),從而增加ho-1蛋白表達(dá),抑制氧化應(yīng)激、降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。3敲低nrf2蛋白表達(dá),能夠促進(jìn)p-p65蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞外il-1β的釋放,提示sa可能通過(guò)激活nrf信號(hào)通路,抑制nf-kb的活化,抑制炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮抗cp介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的損傷。結(jié)論:1蘇木酮a能夠逆轉(zhuǎn)順鉑所致的腎損傷,可能與改善炎癥反應(yīng)和/或氧化應(yīng)激,從而降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。2蘇木酮A通過(guò)上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá),從而增加HO-1蛋白表達(dá),抑制氧化應(yīng)激;抑制NF-κB激活,降低炎癥介質(zhì)釋放,降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)CP所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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1 康林;蘇木酮A對(duì)順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2259284