【摘要】：目的瞬時感受器電位(transient receptor potential,TRP)超家族是一組非選擇性陽離子通道,分為7個亞家族,TRPM亞家族包括8個不同的成員,TRPM1~8。TRPM2在可興奮細胞和非興奮細胞上廣泛表達,其中胰島beta細胞上也發(fā)現(xiàn)了TRPM2的表達,同時它可以形成Ca2+通透性陽離子通道,在胰島beta細胞的胰島素分泌功能中發(fā)揮一定的作用。TRPM2通道可以被細胞內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、H2O2、活性氧(ROS)、溫度以及Ca2+所激活。眾所周知,作為2型糖尿病的一個重要靶點,胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)具有保護胰島beta細胞,刺激其增值和分化,抑制其凋零,增加胰島beta細胞數(shù)量,減輕病人體重,抑制胃腸蠕動和胃液分泌,抑制食欲,延緩胃排空促進胰島素的合成和分泌等作用,然而在它眾多作用當(dāng)中我們對其可以增強葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)作用最感興趣并進行了進一步的深入研究。GLP-1的促胰島素分泌作用呈葡萄糖濃度依賴性,即只有在血糖水平升高的情況下,GLP-1才發(fā)揮降糖作用,而在血糖水平正常時,則不會使其進一步降低。GLP-1的這種葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島beta細胞分泌胰島素,同時減少胰島alpha細胞分泌胰高血糖素,從而降低血糖。細胞外葡萄糖濃度的變化將改變細胞內(nèi)ATP以及cAMP的水平,c AMP水平的變化將影響表達在胰島beta細胞上的TRPM2的狀態(tài),因此這些研究結(jié)果促使我們提出了以下設(shè)想:TRPM2有可能參與了GLP-1調(diào)節(jié)胰島素分泌的功能。本研究將結(jié)合GLP-1和TRPM2作為新視點探索并揭示胰島素分泌調(diào)節(jié)的發(fā)生機制,為預(yù)防治療糖尿病以及其并發(fā)癥開辟了新的道路。方法選取健康Sprague-Dawley大鼠,分離并培養(yǎng)原代細胞。在室溫(22-25oC)下用膜片鉗放大器測量細胞膜電流。采用PCLAMP v.10.2軟件以及Digidata-1440A來發(fā)出指令點刺激并記錄數(shù)據(jù)。將細胞置于位于倒置顯微鏡載物臺上的bath(近似0.15 ml,被維持在37 oC)中,然后以HEPES緩沖的生理鹽水(含3.3mmol/L葡萄糖),高糖、高K+、TRPM2激動劑、TRPM2抑制劑、PKA激動劑和抑制劑、Epac激動劑和抑制劑或10 nM的GLP-1等分子進行孵育,流速為5 ml/min的進行(原代細胞用電阻系數(shù)約為4.5 MΩ的玻璃電極),記錄離子通道電流以及通過記錄電容變化比較不同實驗組中胰島素分泌的差異,并且通過連續(xù)的去極化刺激初步觀察上述刺激對兩相胰島素分泌的影響。經(jīng)過基因靜默和過表達處理的胰島beta細胞,也給予上述分子孵育,記錄離子通道電流、電容變化,并測量胰島素分泌水平。對基因靜默組及過表達組利用Western Blot,RT-PCR及電生理學(xué)測量來確定TRPM2的表達及活性水平。并對各組通過膜片鉗全細胞記錄法記錄離子通道的細胞膜電流強度情況來確定其活性程度,同時利用胰島素分泌實驗加以佐證來確定TRPM2的活性或其表達水平是否與GLP-1的胰島素分泌調(diào)節(jié)作用相關(guān)。結(jié)果1.不同濃度葡萄糖刺激對TRPM2的影響:將原代細胞置于37攝氏度的高糖、正常糖溶液及低糖環(huán)境中15分鐘,對照組和低糖組之間TRPM2電流無明顯差異(P0.05),高糖組TRPM2電流強度峰值高于對照組(P0.05)。2.高鉀及GLP-1對TRPM2的影響:10 nM GLP-1刺激原代細胞后利用全細胞記錄法記錄TRPM2的峰值電流,與對照組相比GLP-1刺激可以顯著增強TRPM2電流強度(P0.05)。30 m M KCl刺激對TRPM2無影響(P0.05)。3.TRPM2基因靜默對胰島素分泌的影響:對對照組和siTRPM2組給予不同糖濃度刺激,分別測量0-10分鐘(一相分泌)以及10-60分鐘(二相分泌)的胰島素分泌水平。si TRPM2組與對照組相比,低糖和正常糖濃度水平下胰島素分泌情況無明顯差別(P0.05),但在高糖水平下胰島素一相分泌及二相分泌水平較對照組明顯下降(P0.05)。4.高鉀及GLP-1對胰島素分泌的影響:低糖水平下,si TRPM2組,GLP-1組,GLP-1+siTRPM2組胰島素分泌較對照組無明顯變化(P0.05)。KCl刺激以上各組后胰島素分泌水平較對照組均明顯增加(P0.05)。高糖水平下,GLP-1組胰島素分泌較對照組明顯增多(P0.05),GLP-1+si TRPM2胰島素分泌水平與對照組無差別(P0.05)。KCl處理各組后與各組此前的胰島素分泌水平相比無明顯變化(P0.05)。5.2-APB對GLP-1介導(dǎo)的GSIS影響:10μM 2-APB可顯著抑制過表達組及對照組TRPM2電流,GLP-1在高糖水平時可使胰島素分泌水平增加,而2-APB可以使GLP-1組的胰島素分泌水平降低至對照組水平,較之GLP-1組明顯下降(P0.05)。6.PKA、Epac的激動劑及抑制劑對GLP-1介導(dǎo)的GSIS的影響:PKA激動劑及抑制劑對TRPM2電流無顯著影響(P0.05)。與對照組相比,PKA激動劑可以顯著增加GSIS。與GLP-1組相比,PKA抑制劑對GLP-1的促泌作用無明顯影響(P0.05)。Epac激動劑可以顯著增強TRPM2電流,在Epac抑制劑的作用下GLP-1增強TRPM2電流的效果消失。同時Epac激動劑可以顯著提升GSIS,在其作用下GLP-1的加入無法進一步促進胰島素分泌,而Epac抑制劑可抑制GLP-1的胰島素促泌作用(P0.05)。結(jié)論高濃度葡萄糖刺激可以增強TRPM2電流強度,低糖對TRPM2電流無影響。TRPM2參與了葡萄糖刺激的第一時項及第二時項的胰島素分泌。高鉀對TRPM2通道活性無影響,GLP-1可激活TRPM2,并通過此途徑調(diào)節(jié)胰島素分泌,KATP-Cav通路未參與GLP-1介導(dǎo)的GSIS。GLP-1通過Epac通路而非PKA通路調(diào)節(jié)GSIS,PKA通路通過其他作用機制調(diào)節(jié)GSIS,此調(diào)節(jié)作用與GLP-1的GSIS調(diào)節(jié)作用互補。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

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本文編號：2251642