發(fā)布時(shí)間：2018-09-18 13:02

【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?近年來(lái),由于新藥的研發(fā),多發(fā)性骨髓瘤的治療取得了很大的進(jìn)展,但是由于復(fù)發(fā)、耐藥的存在,多發(fā)性骨髓瘤仍是一種不可治愈的血液腫瘤。多發(fā)性骨髓瘤的耐藥機(jī)制現(xiàn)在仍不甚清楚,最近有研究表明,骨髓微環(huán)境中的脂肪細(xì)胞通過(guò)其分泌的脂肪細(xì)胞因子參與骨髓瘤的多藥耐藥,但是哪些脂肪細(xì)胞因子參與這一過(guò)程及具體的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)探討新型脂肪細(xì)胞因子抵抗素在多發(fā)性骨髓瘤多藥耐藥中的作用及相關(guān)分子學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.用馬法蘭、硼替佐米或卡非佐米誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系和骨髓瘤患者骨髓CD138+漿細(xì)胞凋亡,同時(shí)加入不同濃度的抵抗素,用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。2.用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和重要的骨髓瘤細(xì)胞存活信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)情況,同時(shí)應(yīng)用特異性的抑制劑阻斷信號(hào)通路,用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比細(xì)胞凋亡率的變化。3.首先用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抵抗素對(duì)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響,其次用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ABCB1、ABCB3、ABCC1、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2的表達(dá)變化,最后Western blot驗(yàn)證ABCC5和ABCG2蛋白表達(dá)量的變化。同時(shí)用小干擾RNA(si RNA)技術(shù)抑制ABCG2和ABCC5的表達(dá),并觀察ABCG2和ABCC5 si RNA在抵抗素誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系多藥耐藥中的影響。4.用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)檢測(cè)抵抗素對(duì)ABCG2和ABCC5基因甲基化水平的影響,同時(shí)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)抵抗素對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的作用。5.選取多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RP-1建立重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency,SCID)小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將20只小鼠隨機(jī)分為四組,待3周骨髓瘤形成后,用馬法蘭和/或抵抗素處理小鼠。之后,用ELISA檢測(cè)小鼠血漿中的M蛋白含量,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓中CD138+細(xì)胞,用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)和DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)法檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:抵抗素能顯著抑制馬法蘭誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RP-1、MM.1S和U266的細(xì)胞凋亡,并具有濃度依賴性。同時(shí),抵抗素也能抑制硼替佐米和卡非佐米誘導(dǎo)的ARP-1、MM.1S和RPMI8226誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且,抵抗素也可顯著減少馬法蘭誘導(dǎo)的多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓漿細(xì)胞CD138+的凋亡。在ARP-1和MM.1S細(xì)胞中,與馬法蘭處理組相比,抵抗素和馬法蘭處理組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP和Bax顯著減少,而凋亡抑制蛋白Bcl-2和Bcl-Xl顯著增多。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)抵抗素能顯著增加IκBa,Akt,and ERK1/2的磷酸化水平,并且NF-κB和PI3K抑制劑能明顯減弱抵抗素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系的抗凋亡保護(hù)作用。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)抵抗素能顯著提高ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排功能和m RNA的表達(dá),其中ABCG2和ABCC5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在多個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系中均明顯增多,干擾ABCG2和ABCC5基因表達(dá)后,抵抗素對(duì)馬法蘭、硼替佐米和卡非佐米誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡無(wú)保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抵抗素能使ABCG2和ABCC5基因啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低,非甲基化水平明顯提高,同時(shí),抵抗素能顯著減少DNMT1和DNMT3a的m RNA和蛋白表達(dá)量。體內(nèi)試驗(yàn)中,我們用血漿中M蛋白含量來(lái)反映小鼠的腫瘤負(fù)荷,發(fā)現(xiàn)與馬法蘭處理組相比,抵抗素和馬法蘭處理組小鼠血漿M蛋白含量明顯增高,骨髓中CD138+細(xì)胞明顯增多,并且CD138+細(xì)胞凋亡率明顯降低,同時(shí)小鼠骨髓切片TUNEL染色也進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果。結(jié)論:1.抵抗素能抑制多種化療藥物誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞凋亡。2.抵抗素通過(guò)激活抗凋亡信號(hào)通路NF-κB and PI3K/Akt發(fā)揮其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。3.抵抗素能減少甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3a的表達(dá),增加ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量和藥物外排功能,從而發(fā)揮其抗凋亡作用。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了抵抗素在多發(fā)性骨髓瘤多藥耐藥中的促進(jìn)作用。
[Abstract]:EXPERIMENTAL OBJECTIVES: In recent years, great progress has been made in the treatment of multiple myeloma due to the development of new drugs, but multiple myeloma is still an incurable hematological tumor due to recurrence and drug resistance. Cells participate in multidrug resistance of myeloma by secreting adipocytokines, but it is not clear which adipocytokines are involved in this process and the specific mechanism. This study explores the role of novel adipocytokine resistin in multidrug resistance of multiple myeloma and its related molecular mechanisms. Experimental methods: 1. Marfan, boron Tezomib or Carfezomib induced apoptosis of bone marrow CD138 + plasma cells from multiple myeloma cell lines and patients with myeloma. At the same time, different concentrations of resistin were added. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double-labeled flow cytometry. 2. Apoptosis-related proteins and important myeloma cell survival signal pathway-related proteins were detected by Western blot. Specific inhibitors were used to block the signaling pathway and Annexin V-FITC/PI double-labeled flow cytometry was used to compare the changes of apoptosis rate. 3. Firstly, the effect of resistin on the function of ABC transporter protein was detected by flow cytometry. Secondly, the expression of ABCB1, ABCB3, ABCC1, ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCG2 was detected by real-time quantitative PCR. The expression of ABCG2 and ABC5 was inhibited by small interfering RNA (si RNA) technique, and the effect of ABCG2 and ABC5 Si RNA on resistance-induced multidrug resistance in multiple myeloma cell lines was observed. 4. Methylation-specific PCR (MS-PCR) was used to detect the expression of ABCG2 and ABC5 Si RNA. The effects of antibiotics on methylation of ABCG2 and ABC5 genes were detected by real-time quantitative PCR and Western blot. 5. Severe combined immune deficiency (SCID) mice were established by multiple myeloma cell line ARP-1. Twenty mice were randomly divided into four groups and treated with melphalan and/or resistin after 3 weeks of myeloma formation. The M protein content in plasma was detected by ELISA, CD138 + cells in bone marrow were detected by flow cytometry, and Annexin V-FITC/PI flow cytometry and DNA fragmentation in situ end labeling (TUNEL) were used. The results showed that resistin significantly inhibited the apoptosis of MAF-induced multiple myeloma cell lines ARP-1, MM.1S and U266 in a concentration-dependent manner. At the same time, resistin also inhibited the apoptosis of ARP-1, MM.1S and RPMI8226 cells induced by bortezomib and carfezomib. The apoptosis-related proteins cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved PARP and Bax were significantly decreased in ARP-1 and MM.1S cells compared with those in melphalan treatment group, while the inhibitor of apoptosis proteins Bcl-2 and Bcl-Xl were significantly decreased in resistin and melphalan treatment groups. Furthermore, we found that resistin significantly increased the phosphorylation levels of I kappa Ba, Akt, and ERK1/2, and that NF-kappa B and PI3K inhibitors significantly decreased the anti-apoptotic protective effect of resistin on myeloma cell lines. ABC5 transporters were significantly increased in multiple myeloma cell lines. After interfering with ABCG2 and ABC5 gene expression, resistin had no protective effect on myeloma cell apoptosis induced by melphalan, bortezomib and carfezomib. In vivo, we used the M protein content in plasma to reflect the tumor load in mice. We found that the M protein content in plasma of the mice treated with resistin and melphalan was significantly higher than that of the mice treated with melphalan, and the CD138 + cells in bone marrow were significantly increased. Conclusion: 1. Resistin can inhibit the apoptosis of myeloma cells induced by various chemotherapeutics. 2. Resistin exerts its protective effect on myeloma cells by activating the anti-apoptosis signaling pathway NF-kappa B and PI3K/Akt. Resistin can reduce the expression of methyltransferase DNMT1 and DNMT3a, increase the expression of ABC transporter protein and drug efflux function, so as to play its anti-apoptosis role. 4. In vivo experiments further confirmed the role of resistin in promoting multidrug resistance in multiple myeloma.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.3

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本文編號(hào)：2248005