【摘要】：能量代謝異常是腫瘤細(xì)胞的重大特征之一,主要表現(xiàn)為依賴(lài)有氧糖酵解進(jìn)行能量代謝。有氧糖酵解代謝酶是調(diào)控有氧糖酵解代謝途徑的核心元件,其表達(dá)水平及活性異常與多種腫瘤的惡性化程度密切相關(guān),是當(dāng)前腫瘤代謝領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。然而,目前對(duì)于代謝酶參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能認(rèn)識(shí)仍非常有限,大多停留于傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)的腫瘤細(xì)胞惡性化增殖所必須的能量供給和生物合成兩大方面。事實(shí)上,新近有證據(jù)提示,代謝酶可能貢獻(xiàn)于腫瘤細(xì)胞惡性微環(huán)境的維持、表觀遺傳調(diào)控、侵襲遷移等諸多方面。全面認(rèn)識(shí)代謝酶參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能,深入認(rèn)識(shí)其分子機(jī)制,對(duì)于揭示腫瘤代謝在腫瘤惡性化進(jìn)程中的作用具有重要意義,也將為靶向腫瘤代謝的抗腫瘤策略提供重要的理論依據(jù)。磷酸甘油酸變位酶PGAM1是有氧糖酵解途徑的重要代謝酶,通過(guò)催化3-磷酸甘油酸(3-PG)向2-磷酸甘油酸(2-PG)的轉(zhuǎn)變,參與有氧糖酵解途徑,在多種腫瘤中高表達(dá)或活性升高。新近研究報(bào)道了PGAM1通過(guò)其酶活功能同時(shí)調(diào)控磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑,支持腫瘤細(xì)胞快速增殖的重要功能。PGAM1成為腫瘤代謝領(lǐng)域備受關(guān)注的分子。然而,關(guān)于PGAM1的認(rèn)識(shí)仍非常有限,僅停留于能量供給和生物合成兩方面。本論文旨在全面認(rèn)識(shí)PGAM1的生物學(xué)功能,深入探討其分子機(jī)制,旨在為全面認(rèn)識(shí)PGAM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為指導(dǎo)PGAM1抑制劑的使用及研發(fā)策略提供重要信息。首先,我們選用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),系統(tǒng)研究了干擾PGAM1功能可能影響的信號(hào)通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了預(yù)期的代謝和生物合成相關(guān)通路,PGAM1干擾細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答相關(guān)通路顯著受到了影響。本文將著力對(duì)PGAM1在DNA損傷應(yīng)答中可能扮演的角色進(jìn)行探索。首先,為了確證PGAM1參與DNA損傷應(yīng)答,我們以克隆形成等實(shí)驗(yàn)為指標(biāo),檢測(cè)了干擾PGAM1對(duì)不同類(lèi)型DNA損傷類(lèi)藥物敏感性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGAM1能夠選擇性增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)喜樹(shù)堿(CPT)和順鉑(CDDP)的敏感性,提示可能與CPT和CDDP造成的復(fù)制依賴(lài)的DNA雙鏈斷裂(DSBs)應(yīng)答密切相關(guān)。通過(guò)研究藥物處理后DSBs特異性標(biāo)志物γH2AX變化、dsDNA斷裂情況等多項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化情況,我們發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1不影響初始DSBs損傷水平,但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)缺陷。進(jìn)一步采用DSBs兩條主要修復(fù)通路,即同源重組(HR)或非同源末端連接(NHEJ)的報(bào)告基因系統(tǒng),我們揭示PGAM1特異調(diào)控HR修復(fù),而非NHEJ連接。為了研究PGAM1代謝酶活性是否貢獻(xiàn)于HR修復(fù),我們構(gòu)建了PGAM1酶活突變體。通過(guò)對(duì)比回轉(zhuǎn)野生型或酶活突變型PGAM1,我們發(fā)現(xiàn)PGAM1的DNA損傷修復(fù)功能是酶活依賴(lài)的。同時(shí),使用PGAM1酶活抑制劑PGMI-004A或回補(bǔ)代謝產(chǎn)物methyl-2-PG均確認(rèn)了上述結(jié)果�；赑GAM1同時(shí)參與糖酵解、磷酸戊糖和絲氨酸合成途徑的已有認(rèn)識(shí),我們系統(tǒng)比較了上述三條通路對(duì)于HR修復(fù)功能的貢獻(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PGAM1主要通過(guò)影響磷酸戊糖旁路,參與HR修復(fù)�；匮a(bǔ)磷酸戊糖途徑終產(chǎn)物dNTP能夠逆轉(zhuǎn)PGAM1干擾引起的HR修復(fù)缺陷。為了進(jìn)一步回答PGAM1如何影響磷酸戊糖途徑參與HR修復(fù),本研究聚焦了HR修復(fù)的多個(gè)關(guān)鍵步驟。結(jié)合使用免疫熒光檢測(cè)修復(fù)蛋白foci形成等多項(xiàng)研究手段,發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1影響CPT誘導(dǎo)的DSBs末端的單鏈DNA(ssDNA)暴露、阻礙RPA復(fù)合物的招募。而這一效應(yīng)主要通過(guò)影響DSBs末端處理蛋白CtIP的功能實(shí)現(xiàn)。深入研究發(fā)現(xiàn),PGAM1通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)dNTP的水平,導(dǎo)致p53/p73依賴(lài)的p21轉(zhuǎn)錄激活,后者通過(guò)上調(diào)E3泛素連接酶APC/Cdh1活性,導(dǎo)致CtIP蛋白穩(wěn)定性下降,蛋白水平下調(diào)。至此,本研究對(duì)PGAM1如何影響HR修復(fù)的分子機(jī)制進(jìn)行了詳盡的闡述。依據(jù)上述機(jī)制發(fā)現(xiàn),我們對(duì)PGAM1抑制劑的臨床用藥策略進(jìn)行探索。使用在裸小鼠皮下移植瘤模型,我們發(fā)現(xiàn)干擾PGAM1或聯(lián)用PGAM1抑制劑能夠增強(qiáng)Olaparib對(duì)BRCA野生型移植瘤的抑制作用,干擾PGAM1或聯(lián)用PGMI-004A能顯著下調(diào)腫瘤組織內(nèi)CtIP蛋白水平,導(dǎo)致DNA損傷積累,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上,本論文發(fā)現(xiàn)了PGAM1調(diào)控HR修復(fù)的新功能,并揭示了PGAM1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)dNTP平衡、影響CtIP蛋白穩(wěn)定性,調(diào)控HR修復(fù)通路的分子機(jī)制,為認(rèn)識(shí)PGAM1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的功能提供了新的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上,本論文證實(shí)聯(lián)用PGAM1抑制劑能拓展PARP抑制劑的治療空間,為PARP抑制劑治療BRCA野生型腫瘤帶來(lái)了新契機(jī)。
[Abstract]:Abnormal energy metabolism is one of the most important characteristics of tumor cells, which mainly depends on aerobic glycolysis for energy metabolism. Aerobic glycolytic metabolic enzymes are the core elements regulating the pathway of aerobic glycolysis metabolism. The abnormal expression and activity of these enzymes are closely related to the degree of malignancy of various tumors and are the current research in the field of tumor metabolism. In fact, recent evidence suggests that metabolic enzymes may contribute to the maintenance of malignant microenvironment of tumor cells. It is of great significance to understand the role of metabolic enzymes in tumor genesis and development and their molecular mechanisms in revealing the role of tumor metabolism in the process of malignancy. It will also provide important theoretical basis for anti-tumor strategies targeting tumor metabolism. PGAM1 is an important metabolic enzyme in the aerobic glycolysis pathway. It participates in the aerobic glycolysis pathway by catalyzing the conversion of 3-phosphoglyceric acid (3-PG) to 2-phosphoglyceric acid (2-PG), and has high expression or activity in a variety of tumors. Recently, it has been reported that PGAM1 regulates pentose phosphate and serine biosynthesis pathway simultaneously through its enzyme activity. PGAM1 has become an important molecule in the field of tumor metabolism. However, the understanding of PGAM1 is still very limited, only in the aspects of energy supply and biosynthesis. The role of PGAM1 inhibitors in biological development provides experimental evidence and important information for guiding the use and development of PGAM1 inhibitors. First, we used mass spectrometry-based proteomics techniques to systematically study the possible signaling pathways that interfere with PGAM1 function. In this paper, we will explore the possible role of PGAM1 in DNA damage response. Firstly, to confirm the role of PGAM1 in DNA damage response, we examined the effects of PGAM1 interference on the sensitivity of different types of DNA damage drugs by clone formation and other experiments. It was found that PGAM1 could selectively enhance the cell sensitivity to CPT and CDDP, suggesting that PGAM1 might be closely related to the replication-dependent DNA double strand breaks (DSBs) response induced by CPT and CDDP. We found that interfering with PGAM1 did not affect the initial damage level of DSBs, but resulted in DNA repair deficiencies. Further, we revealed that PGAM1 specifically regulates HR repair, not NHEJ junction, through two major repair pathways, homologous recombination (HR) or non-homologous end-joining (NHEJ) reporter gene system. By comparing PGAM1 with wild-type or mutant PGAM1, we found that the DNA damage repair function of PGAM1 was enzyme-dependent. Meanwhile, PGMI-004A or methyl-2-PG, the enzyme activity inhibitor of PGAM1, were used to confirm the above results. The results showed that PGAM1 participated in HR repair mainly by affecting the pentose phosphate pathway. The end product of the pentose phosphate pathway, dNTP, could reverse the defect of HR repair induced by PGAM1 interference. In this study, we focused on several key steps in HR repair. Combining with immunofluorescence detection of repair protein foci formation, we found that interfering with PGAM1 affected CPT-induced single-stranded DNA (ssDNA) exposure at the end of DSBs, which hindered the recruitment of RPA complexes. In-depth study found that PGAM1 regulated intracellular dNTP levels, resulting in p53/p73-dependent p21 transcription activation, the latter by up-regulating the activity of E3 ubiquitin ligase APC/Cdh1, resulting in decreased stability of CtIP protein, protein level down-regulation. Based on the above mechanism, we explored the clinical strategy of PGAM1 inhibitor. Using subcutaneous transplantation tumor model in nude mice, we found that interfering with PGAM1 or combining with PGAM1 inhibitor could enhance the inhibitory effect of Olaparib on BRCA wild-type transplanted tumor, and interfering with PGAM1 or PGMI-004A significantly. To sum up, we have found that PGAM1 regulates the repair of HR by regulating the level of CtIP protein in tumor tissues, leading to the accumulation of DNA damage and inducing apoptosis. On this basis, this study confirmed that the combination of PGAM1 inhibitors can expand the therapeutic space of PARP inhibitors, and provide a new opportunity for PARP inhibitors to treat BRCA wild-type tumors.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R96

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 MA Wen li;DNA Diagnosis and Gene Therapy:Advances and Prospects in the 21st Century[J];深圳大學(xué)學(xué)報(bào);2000年04期

2 葛學(xué)銘,陸應(yīng)麟,付生法,范文紅,劉爽;A NOVEL HUMAN DNA SEQUENCE WITH TUMOR METASTASIS SUPPRESSIVE ACTIVITY[J];Chinese Journal of Cancer Research;2000年02期

3 曹暉,劉玉萍,小松かつ子,畢培曦,邵鵬柱;DNA Molecular Profiling:A New Approach to Quality Control of Chinese Drugs[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期

4 ;DNA REPAIR CAPACITY IN LUNG CANCER PATIENTS[J];癌變.畸變.突變;2001年04期

5 黃力拉,朱剛勁;被拐賣(mài)及失蹤兒童采血驗(yàn)DNA前的心理問(wèn)題及對(duì)策[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年03期

6 安小惠 ,王一理 ,來(lái)寶長(zhǎng) ,耿一萍 ,司履生;CONSTRUCTION OF HUMAN INTERLUEKIN-18 DNA VACCINE AND IT'S EXPRESSION IN MAMMALIAN CELLS[J];Journal of Xi'an Medical University;2001年02期

7 ;A Study of PCR with DNA Extracted from Single Cell Isolated from Histological Sections[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

8 王軍陽(yáng),范桂香,勝利,袁育康;THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE[J];Academic Journal of Xi'an Jiaotong University;2002年02期

9 董菁 ,成軍 ,王勤環(huán) ,施雙雙 ,王剛 ,斯崇文;CLONING AND ANALYSIS OF THE GENOMIC DNA SEQUENCE OF AUGMENTER OF LIVERR EGENERATION FROM RAT[J];Chinese Medical Sciences Journal;2002年02期

10 ;Real time observation of the photocleavage of single DNA molecules[J];Chinese Science Bulletin;2003年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 Michael J.Siefkes;Cory O.Brant;Ronald B.Walter;;A novel real-time XL-PCR for DNA damage detection[A];漁業(yè)科技創(chuàng)新與發(fā)展方式轉(zhuǎn)變——2011年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2011年

2 ;Hormonal Regulation and Tumorigenic Role of DNA Methyltransferase[A];2011中國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省計(jì)劃生育與生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨生殖健康講習(xí)班論文匯編[C];2011年

3 Dongmei Zhao;Fan Jin;Yuli Qian;Hefeng Huang;;Expression patterns of Dnmtl and Dnmt3b in preimplantational mouse embryos and effects of in-vitro cultures on their expression[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)會(huì)議婦科內(nèi)分泌會(huì)場(chǎng)（婦科內(nèi)分泌學(xué)組、絕經(jīng)學(xué)組、計(jì)劃生育學(xué)組）論文匯編[C];2012年

4 姜東成;蔣稼歡;楊力;蔡紹皙;K.-L.Paul Sung;;在聚吡咯微點(diǎn)致動(dòng)下的DNA雜交行為[A];2008年全國(guó)生物流變學(xué)與生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2008年

5 白明慧;翁小成;周翔;;聯(lián)鄰苯二酚類(lèi)小分子作為DNA交聯(lián)劑的研究[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

6 張曄;杜智;楊斌;高英堂;;檢測(cè)外周血中游離DNA的應(yīng)用前景(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 周紅;鄭江;王良喜;丁國(guó)富;魯永玲;潘文東;羅平;肖光夏;;CpG DNA誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合征的作用及其機(jī)制研究[A];全國(guó)燒傷創(chuàng)面處理、感染專(zhuān)題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

8 ;EFFECTS OF Ku70-DEFICIENT ON ARSENITE-INDUCED DNA DOUBLE STRAND BREAKS, CHROMOSOMAL ALTERATIONS AND CELL CYCLE ARREST[A];海峽兩岸第三屆毒理學(xué)研討會(huì)論文摘要[C];2005年

9 李經(jīng)建;冀中華;蔡生民;;小溝結(jié)合方式中的DNA媒介電荷轉(zhuǎn)移[A];第十三次全國(guó)電化學(xué)會(huì)議論文摘要集（下集）[C];2005年

10 ;The interaction between Levofloxacine Hydrochloride and DNA mediated by Cu~(2+)[A];湖北省化學(xué)化工學(xué)會(huì)2006年年會(huì)暨循環(huán)經(jīng)濟(jì)專(zhuān)家論壇論文集[C];2006年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 袁滿(mǎn);平安：把“領(lǐng)先”作為DNA[N];經(jīng)濟(jì)觀察報(bào);2006年

2 舒放;編織一個(gè)DNA納米桶[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

3 閆潔;英兩無(wú)罪公民起訴要求銷(xiāo)毀DNA記錄[N];新華每日電訊;2008年

4 何德功;日本制成診斷魚(yú)病的“DNA書(shū)”[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2004年

5 本報(bào)記者 張巍巍;DNA樣本也能作假[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

6 周斌偉　鄒巍;蘇州警方應(yīng)用DNA技術(shù)一年偵破案件1887起[N];人民公安報(bào);2011年

7 本報(bào)記者 楊天笑;揭秘“神探”DNA[N];蘇州日?qǐng)?bào);2011年

8 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室教授 李福洋;破除法老DNA的咒語(yǔ)[N];東方早報(bào);2011年

9 常麗君;DNA電路可檢測(cè)導(dǎo)致疾病的基因損傷[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

10 常麗君;效率和質(zhì)量：“DNA制造業(yè)”兩大障礙被攻克[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 唐陽(yáng);基于質(zhì)譜技術(shù)的基因組DNA甲基化及其氧化衍生物分析[D];武漢大學(xué);2014年

2 池晴佳;DNA動(dòng)力學(xué)與彈性性質(zhì)研究[D];重慶大學(xué);2015年

3 胡璐璐;哺乳動(dòng)物DNA去甲基化過(guò)程關(guān)鍵酶TET2的三維結(jié)構(gòu)與P暬蒲芯縖D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 馬寅洲;基于滾環(huán)擴(kuò)增的DNA自組裝技術(shù)的研究[D];南京大學(xué);2014年

5 黃學(xué)鋒;精子DNA碎片的臨床意義：臨床和實(shí)驗(yàn)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 隋江東;APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

7 劉松柏;結(jié)構(gòu)特異性核酸酶FEN1在DNA復(fù)制及細(xì)胞周期過(guò)程中的功能性研究[D];浙江大學(xué);2015年

8 王璐;哺乳動(dòng)物中親本DNA甲基化的重編程與繼承[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

9 齊文靖;染色質(zhì)改構(gòu)蛋白BRG1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用及機(jī)制研究[D];東北師范大學(xué);2015年

10 龍湍;水稻T-DNA插入突變?nèi)后w側(cè)翼序列的分離分析和OsaTRZ2的克隆與功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 董洪奎;面向可視化納米操作的DNA運(yùn)動(dòng)學(xué)建模及誤差實(shí)時(shí)校正方法[D];沈陽(yáng)理工大學(xué);2014年

2 聞金燕;水溶性羧基和吡啶基咔咯大環(huán)與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

3 江懌雨;水溶性羧酸卟啉及其配合物與DNA和人血清蛋白的相互作用[D];華南理工大學(xué);2015年

4 高志森;比較外周游離循環(huán)腫瘤DNA與癌胚抗原監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)前后腫瘤負(fù)荷變化的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

5 丁浩;血漿循環(huán)DNA完整性及多基因甲基化對(duì)肺癌診斷價(jià)值的研究[D];河北大學(xué);2015年

6 王鵬;基于碳點(diǎn)@氧化石墨烯復(fù)合材料DNA生物傳感器的構(gòu)建及用于PML/RARα基因檢測(cè)[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

7 李海青;轉(zhuǎn)堿篷和鹽角草總DNA的耐鹽紫花苜蓿的選育[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

8 李婷婷;小鼠DNA模式識(shí)別重要受體的分子結(jié)構(gòu)特征及其功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

9 劉瑞斯;抗癌藥物奧沙利鉑與DNA相互作用的原子力顯微鏡觀察研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 熊忠;芳香二肽與一價(jià)金屬離子間相互作用及DNA切割活性的研究[D];鄭州大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2228037