【摘要】：目前,結(jié)直腸癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率逐年上升。結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)為主,輔以放化療,但療效欠佳,尤其是中晚期結(jié)直腸癌治療效果更差。闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并為臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)顯得尤為重要。microRNA是一類(lèi)具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA,通常包含19-24個(gè)核苷酸。成熟的miRNA是由較長(zhǎng)的pre microRNAs經(jīng)過(guò)一系列核酸酶切反應(yīng)加工形成,可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因3'UTR區(qū)非編碼mRNA,與之相結(jié)合從而降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯。miRNAs通過(guò)不同的靶基因,參與調(diào)控了生物體多種生命進(jìn)程,比如腫瘤發(fā)生和發(fā)展、器官造血、組織發(fā)育和分化、細(xì)胞增殖和凋亡及基礎(chǔ)代謝等；同時(shí)miRNAs還可以對(duì)多種生物體基礎(chǔ)信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用�；诖�,miRNA對(duì)于腫瘤潛在的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。本課題從結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞miRNA芯片中篩選出miR-214作為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和放療抵抗候選miRNA,探討miR-214在結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和放療抵抗中的作用機(jī)制,主要內(nèi)容如下：(1)篩選并驗(yàn)證結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和放療抵抗相關(guān)的miRNA;(2)預(yù)測(cè)并鑒定miR-214的靶基因,明確miR-214通過(guò)其靶基因如何在結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和放療抵抗中發(fā)揮作用；(3)確定miR-214上游轉(zhuǎn)錄因子,探討兩者之間的相互調(diào)控關(guān)系及轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和放療抵抗中的作用。本課題旨在揭示miR-214新的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,闡明FOXD3/miR-214/靶基因軸在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,為腫瘤診治提供新的思路及治療靶點(diǎn)。研究方法1.結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中異常表達(dá)miRNAs篩選及驗(yàn)證利用miRNA芯片初步篩選出在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中差異表達(dá)明顯且與轉(zhuǎn)移和放療相關(guān)的miR-214,利用熒光定量PCR驗(yàn)證miR-214在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)情況。2. miR-214靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定以miR-214為關(guān)鍵詞,使用miRanda、TargetScan、Pictar和RNAhybrid數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-214靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),挑選交集多且預(yù)測(cè)值高并通過(guò)查閱文獻(xiàn)尋找轉(zhuǎn)移和放療相關(guān)靶基因MED19和CDC25A,采用雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行確定,并利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)miR-214及其靶基因在六株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)并進(jìn)行相關(guān)性分析。3.miR-214對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(1)設(shè)計(jì)并構(gòu)建miR-214慢病毒表達(dá)載體,進(jìn)行慢病毒包裝,感染SW480和HCT116細(xì)胞,經(jīng)流式細(xì)胞儀分選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,利用熒光定量PCR驗(yàn)證miR-214的表達(dá)；(2)將miR-214慢病毒表達(dá)載體和不含3'UTR的兩個(gè)靶基因(MED19和CDC25A)編碼區(qū)表達(dá)慢病毒載體共轉(zhuǎn)染至SW480和HCT116細(xì)胞中,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,利用Western blot檢測(cè)MED19和CDC25A的表達(dá)變化；(3)采用CCK-8、平板克隆、體外侵襲、Western blot及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-214表達(dá)載體及miR-214和靶基因(不含3'UTR)共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和HCT116體外增殖、侵襲及放療耐受的影響；(4)利用整體可視化動(dòng)物模型,檢測(cè)miR-214表達(dá)載體及miR-214和MED19(不含3'UTR)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480對(duì)裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力的影響。4.miR-214上游轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)并驗(yàn)證及體內(nèi)外功能研究(1)尋找miR-214上游啟動(dòng)子的基因組序列,在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)可能與miR-214啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-214啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響,并用染色質(zhì)免疫共沉淀驗(yàn)證兩者之間具體的結(jié)合位點(diǎn)；利用熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)后miR-214表達(dá)情況。(2)利用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXD3的表達(dá),設(shè)計(jì)并構(gòu)建干擾FOXD3慢病毒表達(dá)載體,并將shFOXD3慢病毒載體及shFOXD3/miR-214慢病毒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620中,經(jīng)流式細(xì)胞儀分選穩(wěn)定細(xì)胞株,利用Western blot和熒光定量PCR檢測(cè)FOXD3和miR-214的表達(dá)。(3)利用CCK-8、平板克隆、體外侵襲、Western blot及細(xì)胞免疫熒光方法,檢測(cè)shFOXD3及shFOXD3/miR-214對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620體外增殖、侵襲及放療的影響；(4)利用整體可視化動(dòng)物模型,檢測(cè)SW620/shFOXD3及SW620/shFOXD3/miR-214對(duì)裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力的影響。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析,方差分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊采用oneway Anova,多重比較采用LSD法；方差不齊采用近似F檢驗(yàn)的Welch法,多重比較采用Dunnett's T3法；多組均數(shù)多重比較采用析因方差分析,兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。研究結(jié)果1.結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及放療相關(guān)miRNA的篩選及鑒定(1)送檢3張miRNA芯片結(jié)果表明,與正常結(jié)直腸粘膜組相比,在結(jié)直腸癌組及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中共篩選出42個(gè)表達(dá)均下調(diào)的miRNA,其中包括miR-214。本課題組對(duì)結(jié)直腸癌SW837細(xì)胞8Gy放療前后送檢miRNA芯片,結(jié)果表明,與放療前比,放療后SW837細(xì)胞中miR-214表達(dá)顯著降低,提示miR-214與侵襲、轉(zhuǎn)移和放療密切相關(guān)。(2)利用熒光定量PCR檢測(cè)30例配對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織中miR-214的表達(dá),通過(guò)配對(duì)樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-214在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于正常粘膜組織(t=2.285,P0.001)；進(jìn)一步將30例結(jié)直腸癌組織分為伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組及不伴有轉(zhuǎn)移組,結(jié)果表明,miR-214在伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著低于不伴轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌組織(t=2.175,P0.001)。熒光定量PCR檢測(cè)miR-214在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá),單因素方差分析顯示,miR-214在5株細(xì)胞之間的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.632, P0.001)。SW480和HCT116細(xì)胞分別在OGy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy劑量放療,24小時(shí)后收集細(xì)胞,熒光定量PCR檢測(cè)miR-214表達(dá),結(jié)果表明,隨著放療劑量增加miR-214表達(dá)是逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1029.532, P0.001; F=618.172, P0.001)。2.miR-214靶基因的預(yù)測(cè)及鑒定(1)miR-214轉(zhuǎn)移和放療抵抗相關(guān)靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)通過(guò)四個(gè)常用在線(xiàn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)預(yù)測(cè)與miR-214相互作用的靶基因,結(jié)果顯示MED19(4個(gè)軟件均預(yù)測(cè)到)與增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān),CDC25A (2個(gè)軟件預(yù)測(cè)到)與放療相關(guān)。因此,我們假設(shè)MED19和CDC25A作為miR-214的靶基因。(2)在HEK293A、SW480和HCT116細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染psiCHECKTM-2-MED19-3'UTR載體結(jié)果顯示：與Mock組和MED19組比,miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.426, P0.005; F=59.820, P0.001;F=73.500,P0.001),表明miR-214能夠與MED193'UTR結(jié)合,從而抑制熒光素酶的活性；轉(zhuǎn)染psiCHECKTM-2-CDC25A-3'UTR載體結(jié)果顯示：與Mock組和CDC25A組比,]miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性均降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.618, P0.010; F=313.848; P0.001; F=100.236, P0.001),表明miR-214能夠與CDC25A3'UTR結(jié)合,從而抑制熒光素酶的活性。(3) Western blot檢測(cè)MED19和CDC25A在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá),結(jié)果表明,MED19在HCT116、SW480、SW620、LOVO、LS174t和HT29細(xì)胞中表達(dá)逐漸降低；CDC25A在HCT116、SW480、LS174t、SW620、LOVO和HT29細(xì)胞中的表達(dá)是逐漸降低。(4)利用Quantity One軟件對(duì)MED19和CDC25A蛋白Western blot結(jié)果進(jìn)行條帶灰度分析,然后分別與miR-214熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,結(jié)果表明在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中,miR-214與靶基因MED19,miR-214與靶基因CDC25A的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.920,P0.001；r=-0.829,P=0.042)。3.miR-214過(guò)表達(dá)及回復(fù)靶基因后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響(1)熒光定量PCR檢測(cè)SW480和HCT116細(xì)胞中miR-214組、Mock組、miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組中的miR-214表達(dá)變化,結(jié)果表明,SW480和HCT116細(xì)胞株中四組間miR-214的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47219.146, P0.001; F=17177.032, P0.001)。兩兩比較結(jié)果表明,與Mock組相比,miR-214組中miR-214表達(dá)顯著增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P0.001),而與miR-214組相比,miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組中miR-214表達(dá)變化不明顯,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.946,P=0.594；P=0.747,P=0.749)。結(jié)果表明miR-214轉(zhuǎn)染成功,并且MED19和CDC25A重新導(dǎo)入后,對(duì)miR-214的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。(2) Western blot檢測(cè)SW480和HCT116細(xì)胞中Mock組、miR-214組、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組的MED19和CDC25A蛋白表達(dá)變化,結(jié)果表明,與Mock組相比,在miR-214組中MED19和CDC25A蛋白表達(dá)明顯下降,而分別重新轉(zhuǎn)染MED19和CDC25A后,MED19和CDC25A蛋白表達(dá)又上升。結(jié)果表明,miR-214能下調(diào)MED19和CDC25A蛋白表達(dá)。(3)CCK-8法檢測(cè)SW480和HCT116細(xì)胞中Mock組、miR-214組、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組的體外增殖能力并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。析因設(shè)計(jì)方差分析表明,MED19靶基因結(jié)果顯示：SW480和HCT116細(xì)胞株中時(shí)間與分組之間交互效應(yīng)有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.77,P0.001；F=62.274,P0.001),生長(zhǎng)時(shí)間水平有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2607.833, P0.001; F=35.355, P0.001),三組間細(xì)胞增殖能力組間有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=271.281, P0.001; F=4.376, P0.001)。兩兩比較結(jié)果表明：SW480細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間第4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P0.05),細(xì)胞增殖能力組間3天、4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P0.05)。CDC25A靶基因結(jié)果顯示：SW480和HCT116細(xì)胞株中時(shí)間與分組之間交互效應(yīng)有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.861,P0.001；F=39.225,P0.001),生長(zhǎng)時(shí)間水平有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2170.620, P0.001; F=1501.804, P0.001),組間細(xì)胞增殖能力有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=227.617, P0.001; F= 173.087, P0.037)。兩兩比較結(jié)果顯示：HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間第4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P0.05),細(xì)胞增殖能力組間4天、5天、6天和7天差異具有顯著性(P0.05)。以上結(jié)果表明,miR-214通過(guò)靶基因(MED19和CDC25A)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖。(4)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480和HCT116細(xì)胞中Mock組、miR-214組和miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組平板克隆形成能力的變化,結(jié)果表明,與Mock組相比,miR-214組平板克隆形成能力顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001)；與miR-214組相比,miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組平板克隆形成能力又增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001)。以上結(jié)果表明,miR-214通過(guò)靶基因(MED19和CDC25A)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞平板克隆形成能力。(5)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同劑量放療后SW480和HCT116細(xì)胞中克隆形成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與Mock組相比,隨著放療劑量增加,miR-214組細(xì)胞的放療敏感性明顯降低,克隆形率升高(P0.001)；與miR-214組相比,miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)放療敏感性又增加,克隆形成率又降低(P0.001)。(6)免疫熒光和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SW480和HCT116細(xì)胞經(jīng)4Gy放療12小時(shí)后,免疫熒光結(jié)果：與Mock組相比,miR-214組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX小體焦點(diǎn)數(shù)量顯著減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；而與miR-214組相比,miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX小體焦點(diǎn)數(shù)量顯著增多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。Western blot結(jié)果：與Mock組相比,miR-214組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)明顯減少；而與miR-214組相比,miR-214/CDC25A共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中γ-H2AX蛋白表達(dá)又增加。上述結(jié)果表明,miR-214通過(guò)CDC25A導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療抵抗。(7)利用Boyden侵襲小室檢測(cè)SW480和HCT116細(xì)胞中Mock組、miR-214組和miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體外侵襲能力變化,SW480和HCT116細(xì)胞的三組間侵襲能力顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=110.710,P0.001；F=95.564,P0.001)。兩兩比較之后發(fā)現(xiàn),與Mock組相比,miR-214組細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)目顯著性減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；與miR-214組相比,miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯增多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)果表明miR-214通過(guò)MED19抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外侵襲能力。(8)采用SW480/Mock、SW480/miR-214與S W480/miR-214/MED 19三組細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤和尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),裸鼠皮下成瘤單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析結(jié)果顯示：三種細(xì)胞皮下成瘤能力都具有明顯差異(F=153.593, P0.001; F=45.355, P0.001; F=53.981, P0.001)。兩兩比較后發(fā)現(xiàn),與Mock組相比,miR-214組皮下瘤生長(zhǎng)速度明顯降低(P0.001)；與miR-214組相比,miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組皮下腫瘤生長(zhǎng)速度明顯上升(P0.001)。免疫組織化學(xué)染色對(duì)皮下瘤進(jìn)行KJ-67染色結(jié)果,Mock組、miR-214組和miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組Ki-67陽(yáng)性率分別為87.84%、19.467%和59.58%。裸鼠尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三種細(xì)胞均在肺臟表面可見(jiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶,Mock組、miR-214組和miR-214/MED19共轉(zhuǎn)染組中裸鼠出現(xiàn)肺臟轉(zhuǎn)移率分別為100%(6/6)、33.33%(2/6)和66.67%(4/6)。以上結(jié)果表明,miR-214通過(guò)MED19抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞皮下成瘤及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力。4.miR-214上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)、驗(yàn)證及其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)特性(1)通過(guò)Ensembl在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),獲得編碼miR-214前體序列所在基因的上游2kb作為miR-214的啟動(dòng)子序列。(2)利用Consite和TFsearch在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)并分析可能與miR-214啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子,綜合考慮選擇FOXD3作為miR-214上游轉(zhuǎn)錄因子。(3)利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-214啟動(dòng)子和FOXD3之間的熒光素酶活性,結(jié)果表明,HEK293A和SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGL3-miR-214質(zhì)粒時(shí),與blank組相比,其熒光素酶活性增高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001),表明miR-214啟動(dòng)子序列是有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性；共轉(zhuǎn)染PGL3-miR-214和pEGFP-FOXD3時(shí),與PGL3-miR-214組相比,熒光素酶活性顯著增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001),進(jìn)一步表明FOXD3能夠明顯促進(jìn)miR-214啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。(4)利用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)miR-214啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子FOXD3之間的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果表明,miR-214啟動(dòng)子與FOXD3之間存在著一個(gè)直接結(jié)合位點(diǎn)。(5)熒光定量PCR檢測(cè)SW480和SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-FOXD3質(zhì)粒后miR-214的表達(dá)。結(jié)果表明,兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-FOXD3后,FOXD3的表達(dá)顯著升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-18.038,P0.001；t=-13.877,P0.001),證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。此外,轉(zhuǎn)染pEGFP-FOXD3后,與Mock組相比,兩種細(xì)胞中miR-214表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-31.409,P0.001；t=-17.720,P0.001),提示FOXD3能促進(jìn)miR-214的表達(dá)。(6)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)FOXD3在6種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。結(jié)果表明,FOXD3在HT29、SW620、LS174t、SW480、LOVO和HCT116細(xì)胞中表達(dá)逐漸降低,為進(jìn)一步研究FOXD3與miR-214之間正向調(diào)控關(guān)系,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取SW620和SW480做為干擾FOXD3細(xì)胞株。(7) Western blot檢測(cè)FOXD3三個(gè)干擾片段在SW480和SW620細(xì)胞中干擾效率,結(jié)果表明,siRNA3在SW480和SW620細(xì)胞中干擾效率最高。因此,選用siRNA3片段用來(lái)包被干擾FOXD3慢病毒,構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。利用Western blot檢測(cè)SW480和SW620穩(wěn)定細(xì)胞中NC組、shFOXD3組、shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組中FOXD3蛋白表達(dá)變化,結(jié)果表明,在SW480和SW620細(xì)胞中,與NC組相比,shFOXD3組細(xì)胞中FOXD3蛋白顯著下降,而重新轉(zhuǎn)染miR-214后,FOXD3蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有變化。以上結(jié)果表明,成功構(gòu)建SW480和SW620穩(wěn)定干擾FOXD3細(xì)胞株。(8)CCK-8法檢測(cè)NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620體外增殖能力的影響并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明：SW480和SW620細(xì)胞中時(shí)間與分組之間交互效應(yīng)有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.307,P0.001；F=89.725,P0.001)；3個(gè)組生長(zhǎng)時(shí)間水平有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5395.231,P0.001；F=16869.718,P0.001),組間細(xì)胞增殖能力有明顯差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=330.935,P0.001；F=614.063,P0.001)。兩兩比較結(jié)果表明,與NC組相比,shFOXD3組細(xì)胞增殖速度顯著增加,說(shuō)明干擾FOXD3后能夠增加細(xì)胞體外增殖能力,而與shFOXD3組相比,shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度又降低。結(jié)果表明,FOXD3通過(guò)miR-214抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖能力。(9)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620平板克隆形成能力的影響并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NC組相比,shFOXD3組的平板克隆形成能力明顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001；P0.001)；與shFOXD3組相比,shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組平板克隆形成能力又降低,(P0.001；P0.001),以上結(jié)果說(shuō)明FOXD3通過(guò)miR-214抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞平板克隆形成能力。(10)利用Boyden侵襲小室檢測(cè)NC、shFOXD3、shFOXD3/miR-214對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620體外侵襲能力的影響,結(jié)果顯示SW480和SW620細(xì)胞各組間細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力有顯著性的差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=91.221,P0.001;F=89.463,P0.001),兩兩比較發(fā)現(xiàn),與NC組相比,shFOXD3組細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)目顯著性增多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)；與shFOXD3組相比,shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),結(jié)果表明,FOXD3通過(guò)miR-214抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外侵襲能力。(11)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同劑量放療后SW480和SW620細(xì)胞中NC組、shFOXD3組、shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組的克隆形成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三組之間放療后細(xì)胞克隆形成率沒(méi)有顯著性差異,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(12)免疫熒光和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SW480和SW620細(xì)胞經(jīng)4Gy放療12小時(shí)后,免疫熒光結(jié)果：三組之間細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX小體焦點(diǎn)數(shù)量沒(méi)有明顯變化,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.005)。Western blot結(jié)果：三組之間細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX蛋白表達(dá)變化不明顯。上述結(jié)果表明,在結(jié)直腸癌細(xì)胞中FOXD3可能與放療沒(méi)有明顯的相關(guān)性。(13)采用SW620/NC組、SW620/shFOXD3組和SW620/shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤和尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),裸鼠皮下成瘤單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素的方差分析結(jié)果顯示：三種細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力都具有明顯差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=402.994,P0.001；F=256.014,P0.001；F=41.996,P0.001)。兩兩比較后發(fā)現(xiàn),與NC組相比,shFOXD3組裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)速度明顯增快(P0.001)；與!shFOXD3組相比,shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組皮下腫瘤生長(zhǎng)速度下降(P0.001)。免疫組織化學(xué)染色對(duì)裸鼠皮下瘤進(jìn)行Ki-67染色結(jié)果顯示,NC組、shFOXD3組和shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Ki-67陽(yáng)性率分別37.333%、81.000%和52.000%。裸鼠尾靜脈注射體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：三組細(xì)胞均在肺臟表面可見(jiàn)明顯的轉(zhuǎn)移灶,NC組、shFOXD3組和shFOXD3/miR-214共轉(zhuǎn)染組裸鼠出現(xiàn)肺臟轉(zhuǎn)移率分別為16.667%(1/6)、83.333%(5/6)和50.000%(3/6)。以上結(jié)果表明：FOXD3通過(guò)miR-214抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株皮下成瘤及肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論1、miR-214下調(diào)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和放療敏感密切相關(guān)。2、FOXD3/miR-214/MED19軸抑制結(jié)直腸癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；3、miR-214通過(guò)靶基因CDC25A增強(qiáng)結(jié)直腸癌放療抵抗能力。本研究的創(chuàng)新之處：1、闡明FOXD3/miR-214/MED19軸在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中關(guān)鍵作用,為腫瘤診治提供新的思路及治療靶點(diǎn)。2、提出miR-214可能在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行放射治療前具有預(yù)測(cè)價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34
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本文編號(hào)：2213186