【摘要】：血管基質(zhì)成分(SVF)是從脂肪組組中分離出來的細(xì)胞群,目前已廣泛應(yīng)用于組織再生領(lǐng)域。SVF中含有造血干/祖細(xì)胞,但數(shù)量少并且歸巢能力低。在目前造血干細(xì)胞供者來源困難的情況下,如何對SVF中的造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行有效擴(kuò)增,提高其歸巢能力,是亟需解決的重要問題。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived stromal cells,ADSCs)是一種多能干細(xì)胞,可促進(jìn)移植后的造血重建。然而ADSCs的安全性限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(exosomes)是ADSCs釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的膜性囊泡。exosomes介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制在ADSCs為基礎(chǔ)的治療中發(fā)揮作用。因此本課題擬探討ADSC-exsomes對SVF中造血細(xì)胞增殖和歸巢的作用,為SVF的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù),同時(shí)為造血功能損傷修復(fù)治療提供新的思路。方法:1.I型膠原酶搖床消化人脂肪組織,分離獲取SVF,免疫磁珠分選SVF-CD34+細(xì)胞。通過流式細(xì)胞表型分析、造血干細(xì)胞集落培養(yǎng)、脾集落證實(shí)S VF-CD34+細(xì)胞的造血功能。2.貼壁培養(yǎng)法分離純化ADSCs,鑒定其表型和功能型鑒定。運(yùn)用超濾法和密度梯度離心法從第3代ADSCs中分離ADSCs-exosomes。通過透射電鏡形態(tài)學(xué)、納米顆�？梢曅苑治鱿到y(tǒng)、Western Blot檢測exosomes表面標(biāo)志性蛋白對ADSC-exosomes 進(jìn)行鑒定。3.ADSC-exosomes與SVF-CD34+細(xì)胞共培養(yǎng),不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞比例、細(xì)胞周期及造血干細(xì)胞集落,探討ADSCs-exosomes對細(xì)胞增殖的影響。SVF-CD34+細(xì)胞用CM-DIL標(biāo)記,與ADSC-exosomes共同植入TBI的NOD/SCID小鼠,熒光顯微鏡下觀察SVF-CD34+細(xì)胞在骨髓腔和外周器官的定位,流式細(xì)胞檢測骨髓腔內(nèi)熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù),熒光定量PCR檢測移植前后骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CXCR4mRNA表達(dá)水平,探討ADSCs-exosomes對SVF-CD34+細(xì)胞歸巢的作用。4.ADSC-exosomes與SVF-CD34+共同植入,通過生存分析、血常規(guī)監(jiān)測、骨髓常規(guī)、GVHD評估、流式細(xì)胞hCD45比例等指標(biāo)探討ADSC-exosomes是否有助于SVF-CD34+細(xì)胞的造血重建。研究結(jié)果:1.人脂肪組織中分離的SVF-CD34+細(xì)胞具有造血干/祖細(xì)胞的免疫表型和功能型。2.超濾法結(jié)合密度梯度離心法成功分離ADSC-exosomes。透射電子顯微鏡顯示ADSC-exosmes是一群圓形或橢圓形膜性小囊泡,有完整胞膜,直徑分布在76nm左右,exosomes相關(guān)蛋白CD63、CD9、CD81呈陽性表達(dá),這些結(jié)果均符合exosomes的特性。3.ADSC-exosomes 與 SVF-CD34+共培養(yǎng)后,ADSC-exosomes 對 SVF-CD34+細(xì)胞的增殖呈濃度依賴性,隨濃度增加增殖作用增強(qiáng)。共培養(yǎng)7天仍有足夠的細(xì)胞處于分裂前期,有助于維持其干細(xì)胞特性。ADSC-exosomes能增加SVF-CD34+細(xì)胞CXCR4mRNA表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADSC-exosomes共移植可以使更多的SVF-CD34+細(xì)胞有效歸巢至骨髓腔。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示SDF-1、CXCR4基因轉(zhuǎn)錄水平較移植前升高。4.ADSC-exosomes與SVF-CD34+細(xì)胞共移植的NOD/SCID小鼠,血常規(guī)恢復(fù)時(shí)間較單獨(dú)移植SVF-CD34+細(xì)胞組縮短,骨髓和脾臟中有更高比例的人源細(xì)胞植入。結(jié)論:1.本研究成功建立了從人脂肪組織中分離獲取SVF-CD34+細(xì)胞的方法,并證實(shí)SVF-CD34+細(xì)胞的造血潛能。2.利用超濾法結(jié)合蔗糖密度梯度離心法可以從ADSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清中可以獲得高純度的外泌體樣本。3.ADSC-exosomes支持SVF-CD34+細(xì)胞的體外增殖,提高SVF-CD34+細(xì)胞的CXCR4 mRNA表達(dá)水平。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 ADSC-exosomes有助于SVF-CD34+細(xì)胞的有效歸巢及移植后的造血重建,相關(guān)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4信號通路相關(guān)。這將為SVF在造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)也為SVF-CD34+細(xì)胞體外有效擴(kuò)增提供了新的途徑和解決方法。
[Abstract]:Vascular matrix composition (SVF) is a group of cells isolated from adipose tissue and has been widely used in tissue regeneration. SVF contains hematopoietic stem/progenitor cells, but the number of them is small and the homing ability is low. Adipose-derived stromal cells (ADSCs) are a kind of pluripotent stem cells, which can promote hematopoietic reconstitution after transplantation. However, the safety of ADSCs limits its wide clinical application. Adipose-derived exosomes (exosomes) are the release of ADSCs into cells. Membranous vesicles of external matrix.Exosomes-mediated paracrine mechanism plays a role in ADSCs-based therapy.Therefore, this study is to explore the role of ADSC-exsomes in the proliferation and homing of hematopoietic cells in SVF, providing theoretical basis for the clinical application of SVF, and providing new ideas for the repair and treatment of hematopoietic function damage. Human adipose tissue was digested by enzyme shaking table, and SVF-CD34+ cells were isolated by immunomagnetic beads. The hematopoietic function of SVF-CD34+ cells was confirmed by flow cytometry, hematopoietic stem cell colony culture and spleen colony culture. 2. ADSCs were isolated and purified by adherent culture, and their phenotypes and functional types were identified by ultrafiltration and density gradient centrifugation. ADSCs-exosomes were isolated from ADSCs of the third generation. The surface marker proteins of exosomes were identified by transmission electron microscopy, nanoparticle visibility analysis system and Western Blot assay. SVF-CD34 + cells were labeled with CM-DIL and co-implanted with ADSC-exosomes into TBI NOD/SCID mice. The localization of SVF-CD34 + cells in bone marrow cavity and peripheral organs was observed under fluorescence microscope. The number of fluorescent labeled cells in bone marrow cavity was detected by flow cytometry. The number of bone marrow cavity was detected by fluorescence quantitative PCR before and after transplantation. The expression of CXCR4 mRNA in pulp mononuclear cells and the effect of ADSCs-exosomes on the homing of SVF-CD34+ cells were investigated. Results: 1. SVF-CD34 + cells isolated from human adipose tissue had immunophenotype and functional type of hematopoietic stem/progenitor cells. 2. ADSC-exosomes were successfully isolated by ultrafiltration combined with density gradient centrifugation. Transmission electron microscopy showed that ADSC-exosomes were a group of round or oval membranous vesicles with intact membranes, about 76 nm in diameter, and exosomes were isolated by ultrafiltration. The expression of CD63, CD9 and CD81 was positive. These results were consistent with the characteristics of exosomes. 3. ADSC-exosomes and SVF-CD34 + co-cultured, ADSC-exosomes on the proliferation of SVF-CD34 + cells was concentration-dependent, with the increase of the concentration of proliferation increased. After co-culture for 7 days, there were still enough cells in the pre-division stage to help maintain their stem cells. Characteristics. ADSC-exosomes can increase the expression of CXCR4 mRNA in SVF-CD34+ cells. In vivo experiments confirmed that co-transplantation of ADSC-exosomes can effectively homing more SVF-CD34+ cells into the bone marrow cavity. Real-time quantitative PCR results showed that the transcription levels of SDF-1 and CXCR4 genes were higher than those before transplantation. 4. ADSC-exosomes co-transplanted with SVF-CD34+ cells in NOD/SCID mice. The recovery time of blood routine test was shorter than that of SVF-CD34 + cell transplantation alone, and a higher proportion of human cells were implanted into bone marrow and spleen. Conclusion: 1. A method for isolation and isolation of SVF-CD34 + cells from human adipose tissue was successfully established and the hematopoietic potential of SVF-CD34 + cells was confirmed. 2. Ultrafiltration combined with sucrose density gradient centrifugation was used. High-purity exosomes can be obtained from the supernatant of ADSCs cells. 3. ADSC-exosomes support the proliferation of SVF-CD34 + cells in vitro, and enhance the expression of CXCR4 mRNA in SVF-CD34 + cells. 4. In vivo experiments have confirmed that ADSC-exosomes contribute to the effective homing of SVF-CD34 + cells and hematopoietic reconstruction after transplantation. The mechanism may be related to This will provide experimental basis for the clinical application of SVF in the field of hematopoietic stem cell transplantation, and also provide a new way and solution for the effective expansion of SVF-CD34+ cells in vitro.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R457.7

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本文編號：2211469