【摘要】：眾所周知,高血壓是導(dǎo)致各種心血管疾病發(fā)生的最為關(guān)鍵的危害因素之一,長(zhǎng)期高血壓可以引起心臟結(jié)構(gòu)的異常及高血壓性心肌舒縮功能的損害。其中,最常見(jiàn)的病癥為高血壓性心肌肥厚,主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞代償性肥大,心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖以細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚,最終可導(dǎo)致心律失常、心肌梗死、心力衰竭和心源性猝死。相關(guān)研究揭示,高血壓-心肌肥大-心肌纖維化病理進(jìn)程的發(fā)生除了與持續(xù)高血壓引起的心肌壓力和容量超負(fù)荷有關(guān)外,多種神經(jīng)體液因素也在該病的形成過(guò)程中扮演重要角色,主要包括交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度興奮和β 1-腎上腺受體(β 1-AR)活性的異常增加,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活動(dòng)的異常和相關(guān)細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的活化,如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 1(TGF-β1)及基質(zhì)外金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)等。近年來(lái),逆轉(zhuǎn)左心室肥厚、心肌纖維化及左心室舒縮功能損害被認(rèn)為是治療慢性高血壓的關(guān)鍵環(huán)節(jié),并成為醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。目前,盡管臨床上用于控制血壓、逆轉(zhuǎn)心肌肥大和心功能損害的許多新穎的藥物不斷的涌現(xiàn),但僅有少數(shù)高血壓患者的癥狀能夠得到較理想的控制,究其原因主要是這些藥物的低兼容性,且靶點(diǎn)較為單一,并伴有諸多毒副作用。相關(guān)研究證實(shí),針刺某些穴位具有直接的降壓效應(yīng),其可通過(guò)軀體-自主神經(jīng)反射影響腦干交感中樞核團(tuán)的傳出活動(dòng),或經(jīng)興奮迷走神經(jīng)的功能活動(dòng)來(lái)對(duì)抗慢性高血壓狀態(tài)下交感神經(jīng)的過(guò)度緊張性活動(dòng)及過(guò)度激活的β1-AR。除神經(jīng)機(jī)制外,針刺還可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述參與高血壓病理進(jìn)程的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò),包括RAS、炎癥因子和酶類(lèi)等,從而改善慢性高血壓及誘發(fā)癥狀。此外,針刺內(nèi)關(guān)穴可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及與鈣信號(hào)相關(guān)蛋白有效地改善心功能,適用于心律不齊、心絞痛、心功能不全等多種心血管疾病的治療。因此,進(jìn)一步探索和揭示針刺對(duì)高血壓-心肌肥厚-心功能損害的作用效果具有一定的科學(xué)價(jià)值和潛在的臨床應(yīng)用前景。1實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋狙芯恳?2周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為研究對(duì)象,以同周齡Wistar Kyoto(WKY)作為對(duì)照組,采用無(wú)創(chuàng)血壓記錄和超聲心動(dòng)圖技術(shù),觀察連續(xù)8周電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)SHR模型大鼠血壓和心臟結(jié)構(gòu)、功能動(dòng)態(tài)變化的影響;在確定電針有效改善高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害病理進(jìn)程的基礎(chǔ)上,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、Western Blotting、Real-Time PCR和放射免疫等方法,揭示電針“內(nèi)關(guān)”穴發(fā)揮該效應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制,旨在為高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害的臨床治療提供新的途徑。2實(shí)驗(yàn)方法本研究實(shí)驗(yàn)分兩階段進(jìn)行。第一部分主要觀察電針內(nèi)關(guān)穴抑制SHR左心室肥厚及舒縮功能損害的療效:實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)健康雄性12周齡WKY 10只作為正常組,另選同周齡自SHR30只,分為SHR、SHR+EA、SHR+Sham組,每組大鼠各10只。其中,SHR+EA組選取雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴干預(yù)(2/15Hz,1mA,持續(xù)30min),每日1次,共8周。假電針組僅于內(nèi)關(guān)穴淺刺,不給予電刺激。于電針前和每周電針后采用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量各組大鼠清醒狀態(tài)下下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MAP);采用高分辨率超聲心動(dòng)圖影像系統(tǒng)分別于電針干預(yù)前及電針干預(yù)第2,4,6,8周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查,觀察各組大鼠心肌肥厚指標(biāo)的差異。于電針干預(yù)結(jié)束后稱(chēng)量左心室濕重,并計(jì)算心重體重比(HMI),左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。采用HE染色法、VG染色法,免疫熒光組織化學(xué)染色技術(shù)和Western Blotting等分析法觀察心肌組織病理組織學(xué)改變及心肌組織中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ表達(dá)量的變化。第二部分主要是對(duì)電針內(nèi)關(guān)穴延滯SHR心肌肥厚的機(jī)制探討:實(shí)驗(yàn)選SPF級(jí)健康雄性12周齡SHR18只,分為三組,即SHR、SHR+EA、SHR+Sham組,每組大鼠各6只。同周齡的WKY作為正常血壓對(duì)照組,給予電針干預(yù),干預(yù)方法及參數(shù)同上。于電針干預(yù)結(jié)束后,采用放射免疫法,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa法)和Real-Time PCR測(cè)定檢測(cè)大鼠心肌組織或血清中ACE含量及TNF-α的表達(dá)。采用免疫印跡法(Western Blotting)觀察比較心肌組織AT1R、AT2R、β1-AR、TGF-β 1、CTGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)變化。采用Real-Time PCR法觀察TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。通過(guò)系統(tǒng)分析電針內(nèi)關(guān)穴是否通過(guò)影響上述重要靶點(diǎn)從而達(dá)到改善高血壓心肌肥厚的效應(yīng),以探討哪些因素可能參與了電針內(nèi)關(guān)穴改善高血壓-心肌肥厚的相關(guān)機(jī)制。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1電針緩解SHR左心室肥厚及心功能損害的療效觀察3.1.1電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR血壓的影響各組大鼠動(dòng)態(tài)無(wú)創(chuàng)血壓記錄結(jié)果顯示,與自身的基礎(chǔ)值比較,從電針干預(yù)5周后,SHR+EA組DBP和MAP顯著降低(P0.05)。從電針干預(yù)6周后,SHR+EA組SBP顯著降低(P0.05);而SHR組大鼠SBP、DBP和MAP均顯著升高(P均0.05)。與WKY組比較,SHR組和SHR+Sham組的SBP、DBP和MAP均顯著升高(P均0.05),并隨周齡增加持續(xù)上升。與SHR組比較,從電針內(nèi)關(guān)干預(yù)5周后,SHR+EA組SBP、DBP和MAP均顯著降低(P均0.05),但假電針組MAP、SBP、DBP未見(jiàn)顯著變化,始終與模型組數(shù)值接近,均保持在較高水平(P0.05),提示電針內(nèi)關(guān)穴能夠顯著降低SHR高血壓癥狀。3.1.2電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR大鼠心重體重比和左心室重量指數(shù)的影響與WKY組相比,SHR組的心重/體重比(HW/BW),左室重量指數(shù)(LVWI)顯著升高(P0.001),提示SHR出現(xiàn)心肌肥厚的表現(xiàn)。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR組HW/BW和LVWI的升高幅度(P0.001,P0.01),這表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌肥厚癥狀。3.1.3電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織形態(tài)學(xué)改變的影響光鏡下觀察HE染色心肌切片可見(jiàn):與WKY組比較,SHR組左心室腔明最縮小,心肌明顯增厚,SHR+EA組可明顯改善SHR組左心腔縮小和肌增厚的現(xiàn)象。而與SHR組比較,SHR+Sham組,沒(méi)有明顯變化。與WKY組比較,SHR組心肌細(xì)胞腫脹并且伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。電針干預(yù)八周后,心肌細(xì)胞體積不同程度減小,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕。與WKY組比較,SHR組的心肌細(xì)胞直徑和橫截面積顯著增大(P0.05,P0.001),與SHR組比較,SHR+EA組的心肌細(xì)胞直徑和橫截面積均減小(P0.05,P0.001),而SHR+Sham組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善高血壓心肌肥厚狀態(tài)下心臟結(jié)構(gòu)和局部組織形態(tài)學(xué)的病理改變。3.1.4電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心功能各項(xiàng)指標(biāo)的影響WKY 組隨周齡的增加,其 LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVEF、LVFS 指標(biāo)沒(méi)有顯著變化。與WKY組相比,SHR組LVAWd、LVPWd顯著升高(P0.05,P0.01,P0.001),而 LVEF、LVFS、LVIDd 顯著降低,提示 SHR 出現(xiàn)心肌肥厚表現(xiàn)。與SHR組比較,電針內(nèi)關(guān)穴6周后,SHR+EA組LVAWd顯著降低(P0.01),LVEF、LVFS、LVIDd顯著升高(P0.05,P0.001,P0.001);電針8周后,LVPWd亦顯著降低(P0.05),SHR+Sham組上述各指標(biāo)表現(xiàn)與SHR組一致,兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示電針內(nèi)關(guān)穴可有效緩解SHR心肌肥厚癥狀。WKY隨周齡的增加E/A比值沒(méi)有變化。與WKY組相比,SHR組的E/A比值顯著降低(P0.001),提示SHR出現(xiàn)了心肌舒縮功能的損害。與SHR組比較,電針內(nèi)關(guān)穴6周,SHR+EA組E/A比值顯著升高(P0.05,P0.01,P0.001);SHR+Sham組E/A變化與SHR組一致,且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌舒縮功能。3.1.5電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織膠原分布及羥脯胺酸含量的影響與WKY組比較,SHR組心肌纖維變粗,腫脹、間隙不清、斷裂、融合或排列紊亂,心肌細(xì)胞明顯肥大、濁腫,空泡樣變化;細(xì)胞紅色染色較多,提示膠原纖維增生明顯。與SHR組比較,SHR+EA組上述心肌組織的病理?yè)p傷明顯減輕,紅色范圍逐漸減少,提示心肌纖維化程度逐漸減輕;而SHR+Sham組病理?yè)p傷減輕不明顯。與WKY組相比,SHR組心肌間質(zhì)膠原面積(CA),心肌肌原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、羥脯胺酸(Hyp)的含量顯著增高(P0.01,P0.001)。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR組CA、CVF和Hyp的升高幅度(P0.05,P0.01),提示電針內(nèi)關(guān)穴可有效抑制SHR心肌纖維化表現(xiàn)。與SHR組比較,SHR+Sham組上述三個(gè)指標(biāo)無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌纖維化。3.1.6電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織Ⅰ型Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)的影響依據(jù)免疫染色結(jié)果,與WKY組相比,SHR組心肌間質(zhì)Col Ⅰ、Col Ⅲ熒光共表達(dá)顯著增加,說(shuō)明心肌間質(zhì)膠原沉積現(xiàn)象明顯。與SHR組比較,SHR+EA組心肌間質(zhì)Col Ⅰ、Col Ⅲ熒光共表達(dá)明顯減少,SHR+Sham組Col Ⅰ表達(dá)亦有一定程度的降低、而Col Ⅲ熒光共表達(dá)變化不明顯。定量分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示:與WKY組相比,SHR組心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表達(dá)顯著升高(P0.001);與SHR組比較,SHR+EA組心肌組織Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表達(dá)顯著下降(P0.001),此外,SHR+Sham組心肌組織ColⅠ、Col Ⅲ蛋白表達(dá)也出現(xiàn)一定程度的降低,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明,電針內(nèi)關(guān)穴可通過(guò)下調(diào)ColⅠ、Col Ⅲ蛋白表達(dá)從而緩解SHR心肌纖維化。3.2電針抑制高血壓-心肌肥厚機(jī)制探討3.2.1電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織β1-AR蛋白表達(dá)的影響與WKY組相比,SHR組心肌組織β1-AR蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。與SHR組比較,SHR+EA組心肌細(xì)胞β1-AR蛋白表達(dá)顯著下降(P0.001),提示電針內(nèi)關(guān)穴可能通過(guò)降低心肌細(xì)胞β1-AR表達(dá),從而改善SHR心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程。這表明β1-AR可能是介導(dǎo)電針抑制高血壓心肌肥厚的機(jī)制之一。3.2.2電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR體內(nèi)ACE含量及心肌組織AT1R、AT2R蛋白表達(dá)的影響與WKY組相比,SHR組血清和心肌組織中ACE的含量顯著升高(P0.001)。電針干預(yù)可明顯抑制SHR血清和心肌組織中ACE含量的異常升高(P0.001);SHR+Sham組上述ACE含量與SHR組無(wú)顯著差異。與WKY組相比,SHR組心肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)顯著升高(P0.001),而AT2R蛋白表達(dá)顯著降低(P0.001)。與SHR組比較,SHR+EA組心肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)顯著下降(P0.001),AT2R蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01),提示AT1R、AT2R蛋白可能是電針內(nèi)關(guān)穴改善SHR心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程的分子途徑之一。該部分結(jié)果提示對(duì)血管緊張素系統(tǒng)(ACE、AT1R、AT2R)的調(diào)節(jié)作用可能介導(dǎo)了電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。3.2.3電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR血清TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)的影響與WKY組相比,SHR血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高(P0.001)。與SHR組比較,SHR+EA組血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著下降(P0.001)。這表明TNF-α與高血壓心肌肥厚密切相關(guān),調(diào)節(jié)血清和心肌組織中TNF-α含量及表達(dá)可能是介導(dǎo)電針抑制高血壓心肌肥厚的機(jī)制之一。3.2.4電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織TGF-β1、CTGF表達(dá)的影響與WKY組相比,SHR組心肌間質(zhì)TGF-β 1和CTGF的熒光強(qiáng)度,蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.001)。與SHR組比較,SHR+EA組心肌組織TGF-β 1和CTGF的熒光強(qiáng)度,蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P0.01,P0.001)。提示電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR組TGF-β,和CTGF異常表達(dá)的下調(diào)作用可能介導(dǎo)了電針緩解高血壓心肌肥厚的作用。3.2.5電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響各組間MMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。提示由于各組之間的MMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的區(qū)別,因此,不能肯定MMP-2參與了介導(dǎo)電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。與WKY組相比,SHR組心肌組織MMP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)明顯降低(P0.001)。與SHR組比較,SHR+EA組心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P0.05),但SHR+Sham組MMP-9蛋白表達(dá)及mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化。提示MMP-9可能介導(dǎo)了電針抑制心肌纖維化的進(jìn)程。4結(jié)論SHR除表現(xiàn)為血壓升高外,其左心室壁厚度、HW/BW、LVWI顯著增加,射血功能明顯減弱,CVF及Hyp、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表達(dá)異常增高,說(shuō)明出現(xiàn)心肌肥厚為主要特征的心肌重塑,并伴有心功能受損。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR血壓的升高,改善心室厚度、LVEF等心功能指標(biāo),抑制HW/BW、LVWI等的異常增加,此外,電針內(nèi)關(guān)穴一定程度上改善了 SHR心肌組織形態(tài),減少了SHR心肌細(xì)胞直徑和橫截面積和CVF的過(guò)度增加,抑制了SHR心肌組織Hyp、collagen Ⅰ和collagenⅢ的異常表達(dá),提示電針改善SHR高血壓心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程療效明確。電針內(nèi)關(guān)穴在改善高血壓-心肌肥厚的同時(shí),可以明顯抑制SHR血清或心肌組織中 ACE、β1-AR、AT1R、TNF-α、TGF-β 1、CTGF、MMP-9 的異常農(nóng)達(dá),提示血管緊張素系統(tǒng)、β 1-AR及上述相關(guān)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和酶類(lèi)可能參與了電針抑制SHR模型高血壓-心肌肥大/纖維化的作用機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R245

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2190634