發(fā)布時(shí)間：2018-07-20 09:29

【摘要】：研究背景:AIM2(Absent in Melanoma 2,黑色素瘤缺乏因子2)是一種固有免疫受體。目前有研究指出AIM2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,在多種實(shí)體腫瘤中的表達(dá)異常,同時(shí)還有研究指出AIM2的表達(dá)能抑制人乳腺癌細(xì)胞、小鼠纖維母細(xì)胞等細(xì)胞的增殖。更好的了解AIM2的生物學(xué)功能及其相關(guān)機(jī)制可以幫助我們進(jìn)一步尋找結(jié)直腸癌治療方法。研究目的:本研究旨在了解AIM2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況,以及探索其表達(dá)水平與患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系,同時(shí)研究AIM2的表達(dá)對(duì)于結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響并對(duì)其相關(guān)機(jī)制做初步探討。材料與方法:1、收集外科手術(shù)切除的64例新鮮冰凍結(jié)直腸癌組織標(biāo)本和相應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本,利用熒光定量PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)檢測(cè)AIM2在癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá),并分析其m RNA表達(dá)水平的差異;2、使用免疫組化技術(shù)檢測(cè)68例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本中AIM2的蛋白水平,分析AIM2在結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的蛋白表達(dá)情況,同時(shí)進(jìn)一步分析AIM2的表達(dá)水平與患者臨床病理因素之間的關(guān)系;3、構(gòu)建含有AIM2基因的慢病毒載體,并使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將AIM2基因轉(zhuǎn)染至HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞中,通過熒光定量PCR和Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證AIM2在HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞中是否穩(wěn)定表達(dá);4、利用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)染色、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)來分析AIM2對(duì)HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響;5、選取AIM2轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞,并加入PI3K/AKT(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)傳導(dǎo)通路的特異性激活劑IGF-1(Insulin-like Growth Factors,胰島素樣生長(zhǎng)因子1),再通過Western Blotting技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中p-AKT的水平,從而反映出PI3K/AKT通路的活性水平;6、激活A(yù)IM2轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞的PI3K/AKT通路后,使用細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡率,同時(shí)與未激活PI3K/AKT通路的HCT-116細(xì)胞相對(duì)比,探尋AIM2影響結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。研究結(jié)果:1、熒光定量PCR結(jié)果顯示結(jié)直腸癌中AIM2的m RNA表達(dá)水平要顯著低于正常組織(P0.01);2、結(jié)直腸癌組織中AIM2蛋白的免疫反應(yīng)評(píng)分和染色陽性率均要顯著低于正常組織(P0.01);3、結(jié)直腸癌組織中AIM2蛋白的免疫反應(yīng)評(píng)分與腫瘤的分化等級(jí)密切相關(guān),腫瘤分化程度越低,AIM2的蛋白水平越低,而與年齡、性別、腫瘤位置、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床特征未見明顯相關(guān)性;4、使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將AIM2成功轉(zhuǎn)染至HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞中,熒光定量PCR和Western Blotting的結(jié)果顯示,與空載體轉(zhuǎn)染相比,AIM2載體轉(zhuǎn)染的HCT-116細(xì)胞中,AIM2的m RNA及蛋白水平均有顯著的上升(P0.01);5、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AIM2轉(zhuǎn)染后的HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞較空載體轉(zhuǎn)染組相比,具有活性的細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(P0.01),細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減慢。這提示AIM2的表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖;6、經(jīng)過AIM2轉(zhuǎn)染后的HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞與空載體轉(zhuǎn)染組相比,其凋亡率發(fā)生顯著的下降(P0.05);7、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示AIM2轉(zhuǎn)染后的HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞中處于S期的細(xì)胞比例下降,而處于G1和G2/M期的細(xì)胞比例則顯著升高(P0.05);8、Transwell小室實(shí)驗(yàn)提示AIM2的表達(dá)對(duì)于HCT-116結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力未有明顯影響;9、Western Blotting的結(jié)果顯示未受到IGF-1激活的AIM2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和空載細(xì)胞中p-AKT水平未見明顯差異;而在接受IGF-1刺激后,兩組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平均有顯著升高,但是AIM2轉(zhuǎn)染的HCT-116細(xì)胞中p-AKT的蛋白水平則要顯著低于空載體對(duì)照組細(xì)胞中的p-AKT水平(P0.01);10、經(jīng)過IGF-1刺激后,AIM2轉(zhuǎn)染的HCT-116細(xì)胞凋亡率要顯著的低于對(duì)照組,這提示激活PI3K/AKT通路可以在抑制HCT116細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:1、結(jié)直腸癌組織的AIM2表達(dá)水平出現(xiàn)顯著的下降,并且腫瘤分化越差的患者腫瘤組織中AIM2的表達(dá)水平更低。2、AIM2的表達(dá)能顯著的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增值活性,并在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞周期向S期的轉(zhuǎn)化;3、AIM2可以抑制HCT-116細(xì)胞系中PI3K/AKT通路活性,而激活PI3K/AKT通路可以抑制HCT116細(xì)胞的凋亡。從而可推斷出AIM2可通過抑制PI3K/AKT通路的活性從而發(fā)揮促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the expression level and clinical pathological characteristics of human breast cancer cells ( HCT - 116 ) , and to investigate the relationship between the expression level and clinical pathological characteristics of colorectal cancer . Results : 1 . The results showed that the number of apoptotic cells was significantly lower than that in normal tissue ( P0.01 ) . Conclusion : 1 . The level of expression of p - glycoprotein in HCT - 116 cells transfected with AIGF - 1 is significantly lower than that in the control group .
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.34

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本文編號(hào)：2133104