【摘要】：研究背景:AIM2(Absent in Melanoma 2,黑色素瘤缺乏因子2)是一種固有免疫受體。目前有研究指出AIM2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,在多種實體腫瘤中的表達異常,同時還有研究指出AIM2的表達能抑制人乳腺癌細胞、小鼠纖維母細胞等細胞的增殖。更好的了解AIM2的生物學功能及其相關機制可以幫助我們進一步尋找結直腸癌治療方法。研究目的:本研究旨在了解AIM2在結直腸癌組織中的表達情況,以及探索其表達水平與患者相關臨床病理特征之間的關系,同時研究AIM2的表達對于結直腸癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響并對其相關機制做初步探討。材料與方法:1、收集外科手術切除的64例新鮮冰凍結直腸癌組織標本和相應的癌旁正常組織標本,利用熒光定量PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應)技術檢測AIM2在癌組織及相應癌旁正常組織中的表達,并分析其m RNA表達水平的差異;2、使用免疫組化技術檢測68例手術切除的結直腸癌組織和相應癌旁正常組織的石蠟標本中AIM2的蛋白水平,分析AIM2在結直腸癌組織及相應癌旁正常組織中的蛋白表達情況,同時進一步分析AIM2的表達水平與患者臨床病理因素之間的關系;3、構建含有AIM2基因的慢病毒載體,并使用慢病毒轉染技術將AIM2基因轉染至HCT-116結直腸癌細胞中,通過熒光定量PCR和Western Blotting技術驗證AIM2在HCT-116結直腸癌細胞中是否穩(wěn)定表達;4、利用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)染色、細胞凋亡實驗、細胞周期實驗和Transwell小室實驗來分析AIM2對HCT-116結直腸癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響;5、選取AIM2轉染和空載體轉染的HCT-116結直腸癌細胞,并加入PI3K/AKT(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)傳導通路的特異性激活劑IGF-1(Insulin-like Growth Factors,胰島素樣生長因子1),再通過Western Blotting技術檢測結直腸癌細胞中p-AKT的水平,從而反映出PI3K/AKT通路的活性水平;6、激活AIM2轉染和空載體轉染的HCT-116結直腸癌細胞的PI3K/AKT通路后,使用細胞凋亡實驗檢測兩組細胞的凋亡率,同時與未激活PI3K/AKT通路的HCT-116細胞相對比,探尋AIM2影響結直腸癌細胞凋亡的可能機制。研究結果:1、熒光定量PCR結果顯示結直腸癌中AIM2的m RNA表達水平要顯著低于正常組織(P0.01);2、結直腸癌組織中AIM2蛋白的免疫反應評分和染色陽性率均要顯著低于正常組織(P0.01);3、結直腸癌組織中AIM2蛋白的免疫反應評分與腫瘤的分化等級密切相關,腫瘤分化程度越低,AIM2的蛋白水平越低,而與年齡、性別、腫瘤位置、T分期、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期等臨床特征未見明顯相關性;4、使用慢病毒轉染技術可以將AIM2成功轉染至HCT-116結直腸癌細胞中,熒光定量PCR和Western Blotting的結果顯示,與空載體轉染相比,AIM2載體轉染的HCT-116細胞中,AIM2的m RNA及蛋白水平均有顯著的上升(P0.01);5、MTT實驗結果顯示,AIM2轉染后的HCT-116結直腸癌細胞較空載體轉染組相比,具有活性的細胞的數(shù)量顯著減少(P0.01),細胞生長顯著減慢。這提示AIM2的表達可以抑制結直腸癌細胞的增殖;6、經過AIM2轉染后的HCT-116結直腸癌細胞與空載體轉染組相比,其凋亡率發(fā)生顯著的下降(P0.05);7、細胞周期實驗的結果提示AIM2轉染后的HCT-116結直腸癌細胞中處于S期的細胞比例下降,而處于G1和G2/M期的細胞比例則顯著升高(P0.05);8、Transwell小室實驗提示AIM2的表達對于HCT-116結直腸癌細胞的侵襲能力未有明顯影響;9、Western Blotting的結果顯示未受到IGF-1激活的AIM2轉染的細胞和空載細胞中p-AKT水平未見明顯差異;而在接受IGF-1刺激后,兩組細胞中p-AKT的表達水平均有顯著升高,但是AIM2轉染的HCT-116細胞中p-AKT的蛋白水平則要顯著低于空載體對照組細胞中的p-AKT水平(P0.01);10、經過IGF-1刺激后,AIM2轉染的HCT-116細胞凋亡率要顯著的低于對照組,這提示激活PI3K/AKT通路可以在抑制HCT116細胞的凋亡。結論:1、結直腸癌組織的AIM2表達水平出現(xiàn)顯著的下降,并且腫瘤分化越差的患者腫瘤組織中AIM2的表達水平更低。2、AIM2的表達能顯著的抑制結直腸癌細胞的增值活性,并在一定程度上促進細胞的凋亡,抑制細胞周期向S期的轉化;3、AIM2可以抑制HCT-116細胞系中PI3K/AKT通路活性,而激活PI3K/AKT通路可以抑制HCT116細胞的凋亡。從而可推斷出AIM2可通過抑制PI3K/AKT通路的活性從而發(fā)揮促進結直腸癌細胞凋亡的作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the expression level and clinical pathological characteristics of human breast cancer cells ( HCT - 116 ) , and to investigate the relationship between the expression level and clinical pathological characteristics of colorectal cancer . Results : 1 . The results showed that the number of apoptotic cells was significantly lower than that in normal tissue ( P0.01 ) . Conclusion : 1 . The level of expression of p - glycoprotein in HCT - 116 cells transfected with AIGF - 1 is significantly lower than that in the control group .
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

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本文編號：2133104