背景:在我國,胃癌位列所有腫瘤發(fā)病率和死亡率的第二位,嚴重危害我國國民健康�；熓悄[瘤的重要治療手段之一。順鉑是胃癌化療的一線用藥,但因能引起多藥耐藥而制約臨床療效。以往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增強瓦伯格效應增強順鉑耐藥,但也有報導耐藥細胞糖酵解水平降低。故闡明胃癌順鉑耐藥細胞糖酵解特征以及與耐藥性的關系能為逆轉耐藥提供治療思路。目的:研究胃癌順鉑天然耐藥和獲得性耐藥細胞的糖酵解特征,闡明糖酵解對耐藥性的影響和作用機制,研究耐藥細胞通過何種機制調控糖酵解。方法:前期通過濃度梯度誘導法建立胃癌獲得性耐藥細胞BGC823/DDP株,選取MGC803細胞株作為天然耐藥模型,BGC823細胞株作為藥敏感細胞。運用比色法檢測敏感細胞和耐藥細胞糖酵解相關的底物和產(chǎn)物,包括葡萄糖消耗量、丙酮酸和乳酸產(chǎn)量。通過MTS法、流式凋亡和Western Blot檢測敏感細胞和耐藥細胞對糖剝奪和糖酵解抑制劑2-DG的敏感性以及兩種處理與耐藥性的影響。用二維電泳-質譜法得到敏感細胞和耐藥細胞的蛋白差異表達譜,并通過蛋白功能聚類分析篩選出與糖酵解相關的差異蛋白。用siRNA敲除該蛋白,比色法檢測耐藥細胞葡萄糖消耗量、丙酮酸、乳酸和ATP產(chǎn)量。用MTS法、流式凋亡和Western Blot檢測敲除差異蛋白后對耐藥細胞順鉑敏感性的影響。將敏感細胞過表達差異蛋白,用MTS和Western Blot檢測順鉑敏感性。用RT-qPCR、Western Blot及雙熒光素酶報告實驗等手段研究耐藥細胞對差異表達蛋白的調控機制。免疫組化法分析糖酵解相關的差異蛋白在鄰近的非腫瘤胃粘膜組織和胃癌組織表達的差異性,及與病人臨床特征的關系。結果:天然耐藥細胞MGC803和后天獲得性耐藥細胞BGC823/DDP比敏感細胞BGC823糖酵解水平增強,其葡萄糖消耗量更大,丙酮酸和乳酸的產(chǎn)量更高。耐藥細胞對糖剝奪或糖酵解抑制劑2-DG更敏感。抑制糖酵解能逆轉耐藥細胞的耐藥性。二維電泳-質譜分析發(fā)現(xiàn)糖酵解過程中的烯醇化酶ENO1(.Enolase 1)在BGC823/DDP細胞中高表達,Western Blot驗證結果一致。敲除ENO1后耐藥細胞葡萄糖消耗下降,且丙酮酸、乳酸和ATP產(chǎn)量下降,細胞耐藥性降低。敏感細胞BGC823過表達ENO1能提升糖酵解水平,抵抗順鉑引起的凋亡。RT-qPCR結果顯示耐藥細胞中ENO1mRNA水平較敏感細胞輕度下調,說明并非轉錄水平調節(jié)。放線菌酮實驗發(fā)現(xiàn)敏感細胞和耐藥細胞的ENO1蛋白半衰期沒有明顯差異。提示ENO1可能受轉錄后調控。應用micRNA靶點預測得到ENO1可能是miR-22的靶點,RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-22在耐藥細胞中呈低表達。Western Blot檢測提示當在耐藥細胞過表達miR-22模擬物或在敏感細胞使用miR-22抑制劑,則能下調或上調ENO1的表達。雙熒光素酶報告實驗提示miR-22可結合ENO1的3'-UTR區(qū),抑制ENO1 mRNA的功能。耐藥細胞過表達miR-22模擬物或敏感細胞使用miR-22抑制劑,能相應下調或提升細胞糖酵解水平。免疫組化結果發(fā)現(xiàn),ENO1在胃癌中高表達,在非胃癌組織中低表達,ENO1預示著更差的總生存期。結論:本文發(fā)現(xiàn)了胃癌順鉑耐藥細胞糖酵解水平上升、更依賴糖酵解,并通過高表達烯醇化酶ENO1上調糖酵解水平。抑制糖酵解途徑能夠逆轉耐藥。ENO1在耐藥細胞中高表達源于miR-22的轉錄后調控,故miR-22和ENO1可作為抗多藥耐藥的治療靶點。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：2101370