本文選題：CREG + 胰島素抵抗��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：現(xiàn)代社會人體“高積累,低消耗”的活動方式成為人類健康的重大威脅。以人體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂為基本特征的代謝綜合癥(metabolic syndrome,MS)引發(fā)了越來越多的關(guān)注。作為危險因素的集合體,MS與心血管病的死亡率呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,其主要臨床結(jié)局為冠心病或其它類型心血管疾病。肝臟作為人體內(nèi)三大營養(yǎng)物質(zhì):糖,蛋白質(zhì),脂肪的重要代謝器官,其內(nèi)部的穩(wěn)定平衡在維持物質(zhì)代謝中起到了至關(guān)重要的作用。在MS中較為常見的肝臟代謝障礙為非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),具體包括了單純性肝臟脂肪變性,非酒精性脂肪性肝炎,肝硬化等,主要特征為肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積及炎癥反應(yīng),并與肥胖,胰島素抵抗,MS密切相關(guān)。近年來,NAFLD已經(jīng)成為西方發(fā)達國家最為常見的慢性肝臟疾病,隨著我國乙肝病毒的逐步控制以及不良現(xiàn)代生活方式的蔓延,NAFLD亦逐步成為威脅我國公眾健康的主要疾病。目前,代謝綜合癥與肝細胞內(nèi)相關(guān)信號分子活動異常,肝臟脂肪變性等相關(guān)機制仍不清楚,導(dǎo)致治療NAFLD的有效手段匱乏。因此尋找一種有效緩解NAFLD的藥物,并闡明其作用機制,成為熱點問題。近年來有研究發(fā)現(xiàn)E1A激活基因阻遏子基因(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在生物體各個器官內(nèi)均廣泛表達,可以參與誘發(fā)細胞成熟態(tài),維持細胞成熟分化狀態(tài),在維持細胞穩(wěn)定等方面發(fā)揮十分重要的作用。CREG在心血管疾病中的作用較為廣泛,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的作用有抗心肌缺血,抗心肌肥厚,抗炎癥反應(yīng),抗凋亡以及抗纖維化等作用。而上述生物學(xué)效應(yīng)在病理生理過程及信號傳導(dǎo)通路方面都與代謝綜合征及NAFLD存在一定程度的關(guān)聯(lián),基于此,我們推測CREG可能存在一定的肝細胞保護作用。本實驗室的初步研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在CREG基因全身半敲除的小鼠高脂飼養(yǎng)模型中可發(fā)現(xiàn)輕度的糖-脂代謝紊亂。因此推斷CREG是可能參與NAFLD發(fā)病機制中調(diào)節(jié)糖-脂肪代謝的重要分子。本研究通過基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究CREG調(diào)控NAFLD的表型及機制。在研究中,我們運用了分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細胞生物學(xué)等研究方法,圍繞CREG表達量與肝組織及細胞糖代謝、脂肪代謝調(diào)節(jié)關(guān)系,以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)超家族中ASK1-JNK1細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的關(guān)鍵性調(diào)控作用等問題進行了探討。為CREG基因在治療代謝綜合征-NAFLD系列疾病中的應(yīng)用提供了可行的思路。本研究課題的主要研究方法和實驗結(jié)果如下:1.CREG基因表達與NAFLD相關(guān)性研究首先運用分子生物學(xué)手段觀察NAFLD模型后肝臟組織和細胞中CREG表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD模型肝臟組織中CREG基因的m RNA以及蛋白表達均顯著下調(diào)(HFD 0.43±0.04 vs NC 1.00±0.21,P0.05 vs NC;HFD 2.68±1.04 vs NC 5.88±0.92,P0.05 vs NC)。進一步的細胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn),原代肝細胞中CREG蛋白表達量與代表細胞脂肪累積程度的棕櫚酸濃度水平呈負相關(guān)。在禁食/飽食小鼠模型研究中,禁食24小時后,脂肪代謝相關(guān)的信號蛋白PEPCK和G6Pase以及CREG蛋白的表達水平均明顯下調(diào)(P0.05 vs feed)。上述動物模型以及細胞模型實驗表明,CREG基因及蛋白表達量與肝臟組織/細胞中脂肪累積量呈負相關(guān)關(guān)系。在人體肝臟標本CREG蛋白含量檢測顯示,與正常肝臟組織相比,NAFLD組CREG蛋白含量顯著下調(diào)(NAFLD 1.00±0.25 vs normal 2.77±0.34,P0.05)。石蠟切片CREG免疫組化研究顯示,CREG主要分布于肝細胞胞漿,在NAFLD組切片染色中可見CREG蛋白表達有減少趨勢。以上實驗表明,肝臟細胞在細胞內(nèi)脂肪累積的過程中,CREG基因表達水平以及蛋白表達水平顯著下調(diào)。本部分結(jié)論為CREG基因及蛋白表達量可能與肝臟脂肪代謝水平相關(guān)。2.CREG基因表達調(diào)控NAFLD糖代謝、脂肪代謝表型研究首先將CREG肝臟特異性條件性敲除(Conditional knockout,KO),研究高脂飼養(yǎng)(High fat diet,HFD)情況下糖代謝表型及信號通路改變。KO后高脂飼養(yǎng)后,小鼠體重,肝重/體重,肝臟重量都顯著增加。同時,KO組葡萄糖耐量和胰島素耐量指標異常,空腹血糖和空腹胰島素水平以及HOMA-IR顯著增高。Western-blot分析顯示KO組胰島素信號通路相關(guān)分子Irs1/Akt,GSK3β,FOXO1磷酸化水平均顯著下降。進一步的糖原染色顯示糖原在KO后減少。但將CREG肝臟特異性高表達(Transgenic,TG)后,上述指標變化趨勢均被翻轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明,CREG肝臟特異性敲除后HFD可發(fā)生糖代謝紊亂,而CREG高表達(TG)可顯著改善糖代謝。進一步的CREG調(diào)控脂肪代謝研究中,腹部超聲顯示,高脂喂養(yǎng)后KO組小鼠相同觀察點肝臟厚度明顯增加(thickness:4.97±0.25 mm vs 3.53±0.35 mm,P0.05)。HE及油紅O染色顯示,KO顯著增加高脂飼養(yǎng)條件下肝臟脂肪累積,而TG組可逆轉(zhuǎn)高脂肪累積現(xiàn)象。同時,KO-HFD組中游離脂肪酸NEFA,總膽固醇,甘油三酯及肝功指標顯著上升,而TG可顯著改善上述指標。細胞學(xué)形態(tài)學(xué)實驗中原代肝細胞油紅O及脂肪特異性BODIPY-C16熒光染色亦證明了CREG敲除后脂肪累積加重,而高表達CREG可逆轉(zhuǎn)這一趨勢。脂肪代謝相關(guān)信號通路研究中,AMPK及ACC磷酸化水平與CREG表達量正相關(guān),m TOR和p70S6K則呈負相關(guān)。接下來我們檢測了糖代謝、脂肪代謝、炎癥相關(guān)的基因表達水平,結(jié)果顯示CREG高表達后以下基因表達量上升(ABCG1,CYP7A1,PPAR-α,CPT-1a,ACOX-1,UCP2,IL-10,PDK4),同時以下基因表達量下調(diào)(HMGCR,SREBP-1C,FAS,ACCa,CD36,FATP1,FABP1,PPAR-γ,PEPCK,G6PC,IL-1b,IL-6,TNF-α,MCP-1)。上述結(jié)果表明,CREG高表達可顯著改善肝臟組織細胞內(nèi)的脂肪變性,并可減輕肝臟炎癥反應(yīng)。上述實驗證實了CREG在環(huán)境因素HFD誘發(fā)的肝臟脂肪變性的影響,同時我們也在遺傳因素導(dǎo)致肥胖的ob/ob小鼠中驗證了CREG對糖、脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用。CREG蛋白表達量在ob/ob小鼠飼養(yǎng)2w,4w,8w,12w四個時間點逐漸下調(diào)。而肝臟HE及油紅O染色結(jié)果顯示CREG過表達可顯著降低脂肪累積水平。CREG高表達顯著降低血糖和血胰島素水平,改善了ob/ob小鼠的糖代謝紊亂,同時下調(diào)了血脂水平。以上提示CREG高表達可改善ob/ob小鼠糖脂代謝紊亂。綜合上述結(jié)果,CREG高表達可改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂。3.CREG基因表達調(diào)控NAFLD糖代謝、脂肪代謝分子機制研究為明確CREG的具體作用機制,我們用western blotting技術(shù)同時在組織和細胞水平檢測了對肝臟脂肪變性及代謝綜合征起到關(guān)鍵作用的MAPK家族分子MEK,ERK,JNK and P38磷酸化水平,結(jié)果提示,CREG基因敲除組脂肪變性后,JNK磷酸化水平上調(diào),過表達CREG后JNK磷酸化水平下降,其他信號分子未見明顯變化。在糖、脂肪代謝表型層面,應(yīng)用JNK特異性抑制劑可完全翻轉(zhuǎn)CREG敲除后的脂肪變性加重趨勢。同時,我們對人肝臟切片P-JNK和CREG免疫組化染色進行了相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系(r=-0.8686,P0.05)。上述結(jié)果提示CREG調(diào)控糖脂代謝的機制和JNK信號通路密切相關(guān)。接下來,我們進一步分析了JNK1和JNK2兩個亞型在CREG調(diào)控糖脂代謝中的具體作用分工。CREG和JNK1(CREG-JNK1-dual knockout,CREG-JNK1 DKO)或JNK2(CREG-JNK2-dual knockout,CREG-JNK2 DKO)雙敲除小鼠的肝臟HE及油紅O染色顯示,與CREG敲除后高脂飼養(yǎng)組相比,CREG-JNK1-DKO組肝臟脂肪累積減輕,而CREG-JNK2-DKO組無變化。同時,CREG-JNK1-DKO組翻轉(zhuǎn)了CREG敲除后HFD帶來的體重、肝重/體重、血糖、HOMA-IR等指標的惡化趨勢,而CREG-JNK2-DKO無變化。以上提示,CREG對糖脂代謝的調(diào)控作用主要通過JNK1通路完成。為進一步研究CREG分子和JNK的作用方式,我們運用免疫共沉淀及western blotting技術(shù)驗證了肝臟脂肪變性和代謝綜合征中經(jīng)典的信號通路ASK1-MKK4/7-JNK與CREG的共同作用。結(jié)果提示,CREG可以直接與ASK1結(jié)合并調(diào)控其磷酸化水平。同時我們利用原代肝細胞研究了CREG于P-ASK1的變化關(guān)系,ASK1磷酸化水平隨著棕櫚酸濃度的增加而升高,CREG與ASK1磷酸化水平呈負相關(guān)趨勢。以上表明CREG通過與ASK1直接結(jié)合并調(diào)節(jié)其磷酸化水平,進而發(fā)揮其調(diào)控JNK信號通路的作用。綜上所述,本課題首次發(fā)現(xiàn)CREG在肝臟糖代謝及脂肪代謝中的重要作用,并基本闡明了其中CREG-ASK1-JNK信號通路作用機制。首先,通過動物肝臟脂肪變性及細胞脂肪變性模型觀察到細胞脂肪變性時CREG基因和蛋白表達顯著下調(diào),發(fā)現(xiàn)CREG基因表達可能與肝臟脂肪代謝相關(guān);接下來,通過基因敲除技術(shù)及轉(zhuǎn)基因動物模型控制肝細胞內(nèi)CREG表達量,研究其對肝細胞糖及脂肪代謝的影響,發(fā)現(xiàn)CREG可以改善肝臟脂肪變性動物模型的糖代謝及脂肪代謝紊亂;最后,對CREG調(diào)控糖脂代謝的信號通路分析顯示,CREG可通過直接與ASK1結(jié)合后調(diào)節(jié)其磷酸化水平,進而發(fā)揮其抗糖、脂肪代謝紊亂的作用。本課題首次揭示了CREG在肝臟糖代謝及脂肪代謝調(diào)控過程中的作用及對下游MAPK信號通路的調(diào)控機制,為進一步深入挖掘CREG基因的臨床應(yīng)用,提供了新的治療策略和思路。
[Abstract]:鐜頒唬紺句細浜轟綋鈥滈珮縐瘡,浣庢秷鑰椻，

本文編號：2098860