發(fā)布時(shí)間：2018-06-19 05:51

  本文選題：UPLC-MS/MS + 茵陳　； 參考：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：綠原酸是自然界廣泛存在并具有多種生物活性的天然產(chǎn)物,其含量是中藥茵陳質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。茵陳為菊科植物茵陳蒿或?yàn)I蒿的地上干燥部分,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱利濕、利膽退黃的功效,現(xiàn)代藥理研究證實(shí)其還具有抗癌、抗炎和解熱鎮(zhèn)痛作用。中藥茵陳中含有綠原酸類、黃酮類及香豆素類等多種化學(xué)成分。本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)以同時(shí)快速分析茵陳中包括綠原酸在內(nèi)的6種成分的含量,并比較了不同采收時(shí)間、不同采集部位及不同干燥方式處理后樣品中6種成分含量的變化,結(jié)果表明:茵陳藥材中綠原酸的含量顯著高于其它黃酮化合物。此外,在不同月份采集的樣品中,綠原酸含量的分布規(guī)律均呈現(xiàn):葉莖根,冷凍干燥處理蔭干處理,其中4月采集樣品經(jīng)冷凍干燥處理后葉中綠原酸含量最高,為10.823 μg/mg。其他5種黃酮成分的含量變化如3,5,3',4'-四羥基-6,7-二甲氧基黃酮的含量在6月冷凍干燥樣品葉中含量最高;3'-甲氧基薊黃素及薊黃素在茵陳葉中的含量隨著時(shí)間的推移逐漸升高;而金圣草黃素和鼠李檸檬素在茵陳藥材中的含量很低。此次建立的同時(shí)快速分析茵陳中包括綠原酸在內(nèi)的6種成分的方法靈敏度和分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng),為茵陳藥材質(zhì)量控制提供了可借鑒的分析方法。由于綠原酸分子結(jié)構(gòu)中存在5個(gè)酚羥基和一個(gè)羧基,因此具有很高的親水性和較低的親脂性。本實(shí)驗(yàn)采用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在改善綠原酸的親脂性方面做了研究。利用豬胰脂肪酶催化完成了綠原酸乙�；姆磻�(yīng),并摸索出該酶催化綠原酸乙�；磻�(yīng)的最適反應(yīng)條件,即選取甲基叔丁基醚作為反應(yīng)溶劑,乙酸乙烯酯作為�；w,在綠原酸:乙酸乙烯酯=1:6,脂肪酶100 mg,50 ℃條件下,綠原酸的乙�；a(chǎn)率最高。此外,將酶催化反應(yīng)混合物用ODS進(jìn)行分離純化,通過UPLC-MS/MS定性分析以及NMR結(jié)構(gòu)確定,最終得到綠原酸的兩種乙�；锛�1-乙酰綠原酸和1,5-二乙酰綠原酸。多年研究證明綠原酸具有很強(qiáng)的生物活性,但是由于其結(jié)構(gòu)特殊性——酯鍵的存在,使其口服后僅有一小部分可以被完全吸收,而很大一部分在體內(nèi)水解,水解后的綠原酸許多生物活性消失。因此,迫切需要研究合成穩(wěn)定性更高的綠原酸類似物。本研究以奎尼酸二縮丙酮為起始原料,經(jīng)過氧化、羥氨化、催化氫化、�；却罅繉�(shí)驗(yàn)研究,合成了穩(wěn)定性更高的綠原酸類似物,經(jīng)過包括NOE在內(nèi)的NMR分析、以及高分辨質(zhì)譜的檢測(cè),鑒定為3α-咖啡�？崴狨０�,該化合物不僅保留了綠原酸的抗氧化活性和抗HCV病毒活性,同時(shí)還有較高的穩(wěn)定性和較低的毒性。為了驗(yàn)證綠原酸類似物及衍生物的生物活性,找到活性更優(yōu)的天然產(chǎn)物的類似物及衍生物,本文比較了6種化合物在清除DPPH自由基活性、抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧活性、過氧游離基誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用、抑制α-葡萄糖苷酶活性以及抑制二肽基肽酶活性等五個(gè)方面的活性。研究結(jié)果表明:綠原酸類似物3α-咖啡�？崴狨０吩谝种萍�(xì)胞內(nèi)活性氧活性方面優(yōu)于綠原酸,同時(shí)3α-咖啡�？崴狨０�、1-乙酰綠原酸和1,5-二乙酰綠原酸對(duì)過氧游離基誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用也強(qiáng)于綠原酸。盡管上述化合物在離體實(shí)驗(yàn)中均呈現(xiàn)出良好的生物活性,但能否被小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán),需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的,在口服藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究中應(yīng)用廣泛的人源結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞單層模型研究其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性,結(jié)果表明:以綠原酸為母核,經(jīng)過將酯鍵轉(zhuǎn)變?yōu)轷０锋I或酚羥基乙�；�,化合物在Caco-2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng),為新藥的開發(fā)以及臨床用藥提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Chlorogenic acid is a natural product which exists widely in nature and has a variety of biological activity. Its content is an important indicator of the quality control of Chinese herbal medicine. The dry part of the Artemisia Artemisia or Artemisia Artemisia is carried in the "Shennong herbal medicine", which has the effect of clearing heat and dampness and taking advantage of the yellowing, and the modern pharmacological study confirmed its anti-cancer. The antiinflammatory and antipyretic analgesic effects. Chinese herbal medicine contains a variety of chemical constituents such as chlorogenic acid, flavonoids and coumarins. In this paper, a super high performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was established for the simultaneous rapid analysis of 6 components, including chlorogenic acid, and the different harvest time. The results showed that the content of chlorogenic acid in Chinese medicinal herbs was significantly higher than that of other flavonoids. In addition, the distribution rules of chlorogenic acid content in the samples collected in different months were all: leaf stem root, lyophilization treatment and shady treatment, in which the samples were collected in April. The content of chlorogenic acid in the leaves of freeze-dried products was the highest, and the content of other 5 kinds of flavonoids in 10.823 g/mg., such as 3,5,3', 4'- four hydroxyl -6,7- two methoxy flavonoids, was the highest in the leaves of frozen dry samples in June, and the content of 3'- methoxy thistle and thistemin in the leaf of Artemisia gradually increased with the time. At the same time, the determination of 6 components, including chlorogenic acid, is high sensitivity, high resolution and strong stability, which provides a useful analytical method for the quality control of rhin medicinal materials. 5 phenols exist in the molecular structure of chlorogenic acid. The hydroxyl group and a carboxyl group have high hydrophilicity and lower lipophilicity. In this experiment, bioconversion technology was used to improve the lipophilicity of chlorogenic acid. The reaction of chlorogenic acid acetylation was catalyzed by pig pancreas lipase, and the optimum reaction conditions for the enzyme catalyzed chlorogenic acid acetylation were found out. Methyl tert butyl ether was used as reaction solvent and vinyl acetate as an acyl donor. Under the conditions of Lv Yuan acid vinyl acetate =1:6, lipase 100 mg, 50 C, the yield of Lv Yuan acid was the highest. In addition, the enzyme catalytic reaction mixture was separated and purified with ODS, UPLC-MS/MS qualitative analysis and NMR structure were determined, and Lv Yuan was finally obtained. Two acetyl compounds of acid, 1- acetyl chlorogenic acid and 1,5- two acetyl chlorogenic acid, have proved that chlorogenic acid has very strong biological activity for many years. But because of its structural specificity, ester bond, only a small portion of the ester bond can be absorbed completely, and a large part is hydrolyzed in the body and many organisms of chlorogenic acid after hydrolysis. The activity disappears. Therefore, there is an urgent need to study the synthesis of more stable chlorogenic acid analogues. In this study, a large amount of chlorogenic acid analogues with higher stability were synthesized by a large number of experimental studies, such as oxidation, aminohydrylation, catalytic hydrogenation and acylation with two acetone, quinine acid, through NMR analysis including NOE, and high resolution mass spectrometry. The test, identified as 3 alpha caffeoquinic acid amide, not only preserves the antioxidant activity of chlorogenic acid and anti HCV virus activity, but also has high stability and lower toxicity. In order to verify the bioactivity of chlorogenic acid analogues and derivatives, we find analogues and derivatives of natural products with better activity. The activities of the 6 compounds in the removal of DPPH free radical activity, inhibition of active oxygen activity in cells, protection of DNA oxidative damage induced by peroxy free radicals, inhibition of the activity of alpha glucosidase and inhibition of the activity of two peptidylpeptidase, the results showed that the chlorogenic acid like substance 3 alpha cofylquinic acid amide was inhibited in the cells. Active oxygen activity is superior to chlorogenic acid, while 3 alpha cofylquinic acid amides, 1- acetyl chlorogenic acid and 1,5- two acetyl chlorogenic acid are more protective than chlorogenic acid induced DNA oxidative damage induced by peroxy free radicals. Although the above compounds have good bioactivity in the isolated experiments, they can be absorbed into the blood by the small intestine. In this experiment, we need further verification. This experiment uses a widely recognized human source colon cancer Caco-2 cell monolayer model, which is widely accepted in the study of oral drug absorption and transport, to study the absorption and transport properties of human colon cancer cells. The results show that chlorogenic acid is the parent nucleus, after the ester bond is transformed into an amyl amine bond or a phenolic hydroxyl acetylation, the compound is in Caco-2 cells. The transport capacity of monolayer model is enhanced, which provides a theoretical basis for the development of new drugs and clinical medication.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285

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本文編號(hào)：2038759