本文選題：食管鱗狀細(xì)胞癌 + 食管癌前病變�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分CMSP對(duì)ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用目的:本課題通過(guò)研究木鱉子乙醇提取物對(duì)羥基桂皮醛(p-Hydroxylcinnamaldehyde,CMSP)對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及腫瘤標(biāo)志蛋白表達(dá)水平等方面的影響,探討CMSP對(duì)ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用。通過(guò)以上研究為CMSP作為分化誘導(dǎo)劑應(yīng)用于食管癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。方法:1 MTS法檢測(cè)不同濃度CMSP分別作用不同時(shí)間,對(duì)ESCC細(xì)胞(Kyse30、TE-13、Eca109及Kyse180)及正常食管上皮細(xì)胞株HEEC增殖活性的影響。2流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè)不同濃度CMSP分別作用于ESCC細(xì)胞株Kyse30及TE-13后,對(duì)細(xì)胞周期分布及凋亡水平的影響。3在光鏡及電鏡下分別觀察CMSP作用后,對(duì)Kyse30及TE-13形態(tài)的影響。4通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和ELISA技術(shù)分別從mRNA及蛋白分泌水平檢測(cè)CMSP對(duì)Kyse30及TE-13表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原CEA、SCC及腫瘤標(biāo)志物IL-6、MIC-1水平的影響。5通過(guò)Western blotting技術(shù)檢測(cè)CMSP對(duì)Kyse30及TE-13腫瘤標(biāo)志物C-myc及N-myc蛋白表達(dá)水平的影響。6通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CMSP對(duì)Kyse30及TE-13細(xì)胞克隆形成能力的影響;并通過(guò)Transwell小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CMSP對(duì)Kyse30及TE-13細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。同時(shí)采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)CMSP對(duì)Kyse30及TE-13細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白MMP2、E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1cmsp可呈劑量及時(shí)間依賴性抑制escc細(xì)胞株(kyse30、te-13、eca109及kyse180)的增殖活性(p0.01),但對(duì)正常食管上皮細(xì)胞株heec增殖活性無(wú)明顯抑制作用(p0.05)。210-40μg/mlcmsp作用后,kyse30及te-13中周期阻滯于g0/g1期的細(xì)胞比例明顯增高(p0.01),但10-40μg/mlcmsp作用后,annexinv-fitc表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例無(wú)明顯變化,因此提示cmsp對(duì)escc細(xì)胞的抑制作用不依賴于誘導(dǎo)凋亡(p0.05)。3cmsp作用后,kyse30及te-13細(xì)胞可呈明顯梭形改變,且梭形細(xì)胞比例隨著cmsp濃度的增高而增加(p0.01)。4cmsp作用后,kyse30及te-13細(xì)胞中cea、scc、il-6、mic-1mrna及蛋白的表達(dá)水平均明顯下降,且該作用可呈明顯劑量及時(shí)間依賴性(p0.05)。5cmsp作用后,kyse30及te-13細(xì)胞中c-myc及n-myc蛋白的表達(dá)水平均明顯下降,且該作用可呈明顯劑量及時(shí)間依賴性(p0.05)。6與cmsp共培養(yǎng)的kyse30和te-13細(xì)胞,其克隆形成及遷移、侵襲能力均明顯下降(p0.05),同時(shí),細(xì)胞中mmp2及腫瘤細(xì)胞間質(zhì)型標(biāo)志vimentin、n-cadherin的表達(dá)水平均明顯下降(p0.01),而上皮型標(biāo)志e-cadherin的表達(dá)水平明顯增加(p0.05)。結(jié)論:1cmsp可明顯抑制escc細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力,并可顯著抑制escc細(xì)胞中腫瘤相關(guān)抗原及腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平。2cmsp可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化,而非誘導(dǎo)凋亡作用抑制escc細(xì)胞的生物活性。3cmsp對(duì)正常食管上皮細(xì)胞株heec無(wú)明顯抑制作用,因此提示該藥可能具有較小的毒副作用。第二部分cmsp對(duì)escc細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用的機(jī)制研究目的:深入探討cmsp誘導(dǎo)escc細(xì)胞分化的作用機(jī)制,為cmsp應(yīng)用于escc的綜合治療提供科學(xué)依據(jù)。方法:1采用同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量質(zhì)譜技術(shù)(relativeisotopiclabelingandabsolutequantification,itraq)分析cmsp作用后kyse30細(xì)胞中表達(dá)程度變化(3倍)的蛋白,并對(duì)表達(dá)水平變化的蛋白進(jìn)行g(shù)o(geneontology)及pathway分析,篩選cmsp可能作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,初步研究cmsp對(duì)escc細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用的可能機(jī)制。2elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cmsp對(duì)kyse30及te-13細(xì)胞中camp表達(dá)水平的影響。3采用westernblotting技術(shù)檢測(cè)cmsp對(duì)kyse30及te-13中rhoa、p-38、p-p38、erk1/2、p-erk1/2、sapk/jnk及p-sapk/jnk表達(dá)水平的影響。4pulldown技術(shù)檢測(cè)cmsp對(duì)kyse30及te-13中g(shù)tp-rhoa表達(dá)水平的影響。5為深入探討cmsp誘導(dǎo)escc細(xì)胞分化作用的機(jī)理,我們還觀察了camp活性抑制劑sq22536對(duì)cmsp誘導(dǎo)kyse30及te-13分化作用的影響。6分別觀察camp活性促進(jìn)劑forskolin、erk途徑抑制劑pd98059及jnk途徑抑制劑sp600125作用后,kyse30及te-13生物活性的變化,探討forskolin、pd98059及sp600125對(duì)escc細(xì)胞分化作用的影響。結(jié)果:1itraq分析結(jié)果顯示cmsp作用后,kyse30細(xì)胞中有79中蛋白表達(dá)水平下降,而103種蛋白表達(dá)水平增高,經(jīng)過(guò)go及pathway分析,我們發(fā)現(xiàn)其中能注釋到的蛋白共176種,這些蛋白參與了細(xì)胞多種生命活動(dòng)以及生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程,且涉及了cmsp作用后escc細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、camp、胰島素、剪接體、mapk及rho等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。2cmsp作用后,kyse30及te-13細(xì)胞中camp、p-p38的表達(dá)水平均明顯上升(p0.05),而gtp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表達(dá)水平均明顯下降(p0.05)。3camp抑制劑sq22536作用后,cmsp對(duì)kyse30及te-13細(xì)胞的增殖抑制及細(xì)胞周期阻滯作用均明顯減弱(p0.01);sq22536作用后,kyse30及te-13細(xì)胞中cea、scc、il-6、mic-1,c-myc及n-myc的表達(dá)水平明顯增高(p0.01),同時(shí)細(xì)胞gtp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表達(dá)水平均明顯增高(p0.01),但p-p38的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(p0.05)。4forskolin、pd98059及sp600125分別作用后,均可對(duì)kyse30及te-13細(xì)胞產(chǎn)生類似于cmsp的誘導(dǎo)分化作用。因此,對(duì)camp-rhoa-erk/jnk通路的調(diào)控作用可能是cmsp誘導(dǎo)escc分化作用的主要機(jī)制,但p38通路在cmsp分化誘導(dǎo)中的作用及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。結(jié)論:cmsp對(duì)escc細(xì)胞的分化誘導(dǎo)能力與該藥作用后影響camp-rhoa-mapk通路的活性有關(guān),cmsp作用后,表達(dá)水平增高的camp通過(guò)抑制rhoa活化,進(jìn)而抑制erk/jnk途徑的活性可能是cmsp對(duì)escc細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的主要機(jī)制。第三部分cmsp抑制食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用及機(jī)制研究目的:構(gòu)建裸鼠食管癌kyse30細(xì)胞荷瘤裸鼠模型,研究cmsp在體內(nèi)環(huán)境中對(duì)escc細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用,以探討cmsp對(duì)escc細(xì)胞體內(nèi)生物活性的影響。方法:1通過(guò)皮下結(jié)合尾靜脈注射法構(gòu)建裸鼠食管癌kyse30細(xì)胞荷瘤肺轉(zhuǎn)移balb-c/null裸鼠模型,實(shí)驗(yàn)分為5組,第11d開始瘤旁注射藥物,對(duì)照組:每3d瘤旁注射滅菌100μlpbs;cmsp低劑量組:每3d瘤旁注射100μlcmsp(10mg/kg體重);cmsp高劑量組:每3d瘤旁注射100μlcmsp(20mg/kg體重);atra治療組:每3d瘤旁注射100μlatra(10-2mmol/kg體重);cddp治療組:每3d瘤旁注射100μlcddp(2mg/kg體重)。第32d引頸處死各組裸鼠。2觀察各組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)速度及瘤重。3免疫組化及pulldown技術(shù)研究各組裸鼠瘤組織中腫瘤標(biāo)志物c-myc、n-myc,emt相關(guān)蛋白mmp2、e-cadherin、n-cadherin、vimentin及gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的表達(dá)水平。4elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裸鼠外周血中腫瘤分化相關(guān)抗原(cea及scc)及腫瘤標(biāo)志物(il-6及mic-1)的含量。5he染色觀察肺組織轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的形成。6he染色觀察肝、脾、腎等重要臟器的病理改變以評(píng)價(jià)cmsp對(duì)機(jī)體的毒副作用。結(jié)果:1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,cddp、atra及不同濃度cmsp處理組裸鼠腫瘤組織的體積和瘤重均明顯低于對(duì)照組(p0.05),且cmsp處理組瘤組織中未見明顯的凋亡與壞死灶,這與atra處理組瘤組織的表現(xiàn)是一致的;而cddp組裸鼠瘤組織可見明顯凋亡與壞死灶。2裸鼠外周血中分泌型腫瘤相關(guān)抗原cea、scc及腫瘤標(biāo)志物il-6、mic-1的含量均明顯下降(p0.05),同時(shí)瘤組織中腫瘤標(biāo)志蛋白c-myc與n-myc蛋白的表達(dá)水平也明顯下降(p0.01)。3對(duì)照組裸鼠肺組織中,光鏡下可見大小不一的escc細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),而cmsp低、高劑量治療組肺組織中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié),這提示cmsp在體內(nèi)環(huán)境中也具有明顯抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的功能。4免疫組化結(jié)果顯示cmsp作用后,腫瘤組織中mmp2及腫瘤間質(zhì)型標(biāo)志蛋白n-cadherin和vimentin的表達(dá)水平均明顯降低(p0.01),而上皮型標(biāo)志蛋白e-cadherin的表達(dá)水平明顯增加(p0.01),因此cmsp在體內(nèi)環(huán)境中依然可通過(guò)抑制腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。同時(shí),免疫組化及pulldown結(jié)果顯示cmsp作用后,腫瘤組織表達(dá)gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的水平均明顯減低(p0.05)。5裸鼠肝、脾、腎等重要臟器未見明顯組織病理學(xué)改變,提示該藥具有較小的毒副作用。結(jié)論:在體內(nèi)環(huán)境中,cmsp依然可通過(guò)分化誘導(dǎo)作用抑制escc移植瘤的生長(zhǎng)、侵襲活性,進(jìn)一步提示了該藥物在escc綜合治療中的廣泛前景。第四部分cmsp逆轉(zhuǎn)小鼠食管癌前病變進(jìn)程及其免疫調(diào)節(jié)作用研究目的:通過(guò)喂食含4nqo飲用水構(gòu)建小鼠食管癌前病變模型,腹腔注射cmsp觀察其對(duì)食管癌前病變及機(jī)體免疫功能的影響,從而深入地探討cmsp對(duì)escc發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的影響,為cmsp應(yīng)用于escc的綜合防治提供科學(xué)數(shù)據(jù)。1通過(guò)喂食含100μg/ml4nqo飲用水法,構(gòu)建小鼠c57bl/6食管癌前病變模型小鼠,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組,模型組,cmsp預(yù)防組,cmsp治療組及atra治療組。實(shí)驗(yàn)持續(xù)30w�？瞻讓�(duì)照組30w內(nèi)均給予無(wú)菌蒸餾水;模型組小鼠在1-15w給予100μg/ml的4nqo,16-30w給予無(wú)菌蒸餾水;cmsp預(yù)防組小鼠,在1-15w給予100μg/ml的4nqo,同時(shí)從第1w起,每周三次腹腔注射cmsp(20mg/kg體重);cmsp治療組小鼠,在1-15w給予100μg/ml的4nqo,同時(shí)從第16w起,每周三次腹腔注射cmsp(20mg/kg);atra治療組小鼠,在1-15w給予100μg/ml的4nqo,同時(shí)從第16w起,每周三次腹腔注射atra(10-2mmol/kg)。2實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每周三次稱取小鼠體重,并觀察小鼠一般狀態(tài);處死小鼠后,取各食管組織,通過(guò)he染色觀察各組小鼠食管癌前病變進(jìn)展情況。3免疫組化、westernblotting及pulldown技術(shù)研究病變組織中腫瘤標(biāo)志物c-myc、n-myc及gtp-rhoa、p-erk1/2、p-sapk/jnk的表達(dá)水平。4elisa法小鼠外周血中腫瘤分化相關(guān)抗原(cea及scc)及腫瘤標(biāo)志物(il-6及mic-1)的含量。5通過(guò)mts法觀察各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性;elisa法檢測(cè)外周血中ifn-γ、tnf-α及分泌型b7-h4(secretoryb7-h4,sb7-h4)含量;fcm檢測(cè)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群狀態(tài);免疫組化技術(shù)檢測(cè)食管病變組織b7-h4、stat3及p-stat3的表達(dá)水平,全面評(píng)價(jià)cmsp對(duì)模型小鼠機(jī)體免疫功能狀態(tài)的影響及其機(jī)制。6觀察各組小鼠肝、脾、腎等重要臟器的病理改變以評(píng)價(jià)cmsp對(duì)機(jī)體的毒副作用。結(jié)果:1小鼠食管癌前病變模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示cmsp治療組和預(yù)防組小鼠的癌前病變發(fā)生率及病變程度均明顯低于模型對(duì)照組小鼠(p0.05),一般狀態(tài)也明顯改善,且cmsp預(yù)防組小鼠癌前病變的發(fā)生率和病變程度均明顯低于cmsp治療組(p0.05),這提示cmsp對(duì)食管癌前病變具有良好的預(yù)防作用。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn),cmsp治療組與atra治療組小鼠的療效無(wú)顯著差異(p0.05),這進(jìn)一步提示cmsp具有作為分化誘導(dǎo)藥物應(yīng)用于臨床食管癌治療的潛力。2cmsp預(yù)防組和治療組小鼠外周血中腫瘤相關(guān)抗原cea與scc,及腫瘤標(biāo)志物mic-1及il-6的含量均較模型對(duì)照組明顯降低(p0.01),病變組織表達(dá)腫瘤標(biāo)志蛋白c-myc及n-myc的表達(dá)水平也均明顯減低(p0.01)。3cmsp治療及預(yù)防組小鼠食管組織中g(shù)tp-rhoa、p-erk1/2及p-sapk/jnk的表達(dá)水平較模型組明顯下降(p0.05)。4模型組小鼠隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、增殖活性及脾臟指數(shù)均明顯下降(p0.05),而cmsp治療及預(yù)防組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及其對(duì)cona刺激后的增殖活性均明顯高于模型組(p0.05),同時(shí)脾臟指數(shù)也明顯增高(p0.05)。5fcm結(jié)果顯示,模型組小鼠隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),其外周血中cd4~+t細(xì)胞、cd8~+t細(xì)胞及nk細(xì)胞的比例均明顯減低(p0.01),而cd4~+cd25~+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞比例明顯增高,而cmsp治療和預(yù)防組小鼠cd4~+t細(xì)胞、cd8~+t細(xì)胞及nk細(xì)胞的比例均明顯高于模型組(p0.05),cd4~+cd25~+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞比例則明顯低于模型組(p0.05)。6隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),模型組小鼠外周血中sb7-h4、il-6及mic-1含量明顯增高(p0.01),而ifn-γ及tnf-α含量逐漸下降(p0.01);同時(shí)食管組織表達(dá)b7-h4、stat3及p-stat3的水平均明顯增加(p0.01)。cmsp治療及預(yù)防組小鼠外周血中sb7-h4、il-6及mic-1含量均較模型組明顯降低(p0.01),而ifn-γ及tnf-α含量明顯增高(p0.01);同時(shí)食管組織表達(dá)b7-h4、stat3及p-stat3的水平均明顯低于模型組小鼠(p0.01),故cmsp對(duì)食管癌前病變模型機(jī)體免疫功能的促進(jìn)作用可能與其抑制病變組織b7-h4的表達(dá)、從而抑制b7-h4/stat3通路的表達(dá)有關(guān)。7cmsp預(yù)防和治療組肝、脾、腎未見任何異常病理改變,進(jìn)一步說(shuō)明該藥可能具有較小的毒副作用。結(jié)論:1cmsp可通過(guò)誘導(dǎo)分化作用逆轉(zhuǎn)食管癌前病變進(jìn)展過(guò)程。2cmsp可通過(guò)抑制食管癌前病變組織b7-h4的表達(dá)、從而抑制病變組織b7-h4/stat3通路的表達(dá),糾正機(jī)體在癌前病變進(jìn)展過(guò)程中免疫功能的紊亂狀態(tài)。3cmsp可能具有較小的毒副作用,因此在escc綜合防治中具有廣泛前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：2021704