本文選題：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 + 腦出血��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腦出血(intracerebral hematoma,ICH)作為神經(jīng)外科最常見的疾病之一,是現(xiàn)代社會嚴(yán)重威脅人類健康的殺手。雖然神經(jīng)外科血腫清除手術(shù)可以作為挽救ICH患者生命的一項主要的治療措施,但是患者術(shù)后仍然會保留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,讓其最終難以回歸社會。ICH后受損腦組織內(nèi)皮質(zhì)脊髓束的修復(fù)和重塑是促進(jìn)患者肢體運動障礙恢復(fù)的解剖病理學(xué)基礎(chǔ),而軸突的斷裂和損傷會直接影響皮質(zhì)脊髓束的功能。雖然受損死亡后的神經(jīng)元幾乎不能再生,但是神經(jīng)元軸突卻可以表現(xiàn)出一定的再生能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是從骨髓中分離出的一種中胚層來源的多潛能干細(xì)胞,其具備體外擴(kuò)增的能力,不僅能夠分化成為中胚層起源的脂肪、骨和軟骨等組織,而且亦可以分化為內(nèi)外胚層來源的血管內(nèi)皮及神經(jīng)等組織。BMSCs具有較好的增殖能力,易于分離培養(yǎng),自體移植無免疫源性,不受倫理學(xué)限制,越來越多的被應(yīng)用于急性腦損傷相關(guān)疾病治療相關(guān)的實驗中。目前體外模型和動物實驗中已有BMSCs移植能夠促進(jìn)軸突再生的報道。自噬是指通過對蛋白質(zhì)聚集體及受損細(xì)胞器的降解以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定細(xì)胞代謝過程,目前已證實了ICH能夠?qū)е伦允傻募せ�。近期有研究發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元自噬水平的增強(qiáng)促進(jìn)了軸突的再生,減少了軸縮球的形成。在全面檢索文獻(xiàn)和前期工作基礎(chǔ)上,我們推測BMSCs移植能夠有效改善ICH大鼠的神經(jīng)功能障礙,促進(jìn)軸突再生,機(jī)制可能與PI3K-Akt-m TOR通路介導(dǎo)的自噬流增強(qiáng)有關(guān)。為證明此假說,本課題將分以下三部分進(jìn)行詳細(xì)闡述。第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用目的:證實大鼠ICH后BMSCs移植能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,改善神經(jīng)功能障礙。方法:將98只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為三組:1)假手術(shù)組(Sham group);2)腦出血組(ICH group);3)腦出血+BMSCs移植組(BMSCs group)。分離和培養(yǎng)3周齡雄性SD大鼠BMSCs至第三代,流式細(xì)胞儀對BMSCs表面標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。采用注血法復(fù)制SD雌性大鼠ICH模型,將2μL濃度為1×108/m L的BMSCs懸液于造模后1小時經(jīng)腦室注入,檢測如下指標(biāo):1)HE染色觀察術(shù)后3天不同組別受損腦組織的病理變化和細(xì)胞存活狀態(tài);2)免疫熒光檢測造模手術(shù)前及術(shù)后12小時-7天Sry陽性細(xì)胞在血腫周圍受損腦組織內(nèi)的分布;3)TUNEL染色顯示術(shù)后1-7天不同組別受損腦組織細(xì)胞凋亡;4)腦組織含水量測定顯示1-7天受損腦組織水腫情況;5)于造模手術(shù)前及術(shù)后12小時-7天進(jìn)行前置放置實驗、轉(zhuǎn)角實驗和NSS評分,檢測大鼠神經(jīng)功能障礙的變化。應(yīng)用Image Lab5.1及Image J等分析系統(tǒng)對實驗結(jié)果進(jìn)行測定分析。實驗結(jié)果寫成均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式,用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0分析,P0.05則差異具有統(tǒng)計意義。結(jié)果:1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察:接種后一天,原代BMSCs慢慢貼壁。BMSCs核居中,胞體較小,形狀為均和的圓形或者梭形,折光性比較強(qiáng),增殖方式為散在的克隆增殖。待生長抑制期度過后,細(xì)胞平行排列呈現(xiàn)快速的漩渦狀聚集生長。之后細(xì)胞形態(tài)隨著傳代變的更加均勻,形狀多為梭形;2流式細(xì)胞儀對BMSCs表面標(biāo)記物的鑒定結(jié)果:我們將第三代BMSCs進(jìn)行表面標(biāo)記物的鑒定,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示BMSCs的CD106陽性表達(dá)率為74.56%,CD29陽性表達(dá)率為76.11%,CD106和CD29呈陽性表達(dá)。CD54陽性表達(dá)率為5.05%,CD45陽性表達(dá)率為3.88%,CD54和CD45呈陰性表達(dá);3大鼠ICH模型的制備情況:大體觀察ICH大鼠腦組織可見造模手術(shù)的注射點,位于尾狀核正上方。選擇注射點所在平面橫切大鼠腦組織,能夠觀察到血腫位于基底節(jié)區(qū),周圍有局部腦組織損傷,腦室內(nèi)出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血亦可見。HE染色顯示Sham組大鼠腦組織具有正常的組織形態(tài),細(xì)胞間隙正常,神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)有序的排列,胞核形狀均勻規(guī)則。ICH組細(xì)胞間隙增加,血腫周邊受損腦組織可見明顯水腫,神經(jīng)細(xì)胞胞體皺縮,胞漿嗜酸性減弱,細(xì)胞核固縮。BMSCs組受損腦組織形態(tài)改變基本如同ICH組,但周邊組織水腫較輕,變性、壞死的神經(jīng)細(xì)胞明顯較少;4 BMSCs在血腫周圍受損腦組織內(nèi)的分布:BMSCs移植前,免疫熒光結(jié)果顯示無雄鼠來源的Sry陽性細(xì)胞。12小時,Sry蛋白在BMSCs胞核中呈顆粒狀表達(dá)。之后陽性細(xì)胞數(shù)呈逐漸增多的趨勢,于移植后3天達(dá)到峰值。直至14天時血腫周圍受損腦組織內(nèi)仍可見Sry陽性細(xì)胞;5 TUNEL染色檢測結(jié)果:Sham組間或可見TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá),零星分布,著色淺淡。ICH組1-7天TUNEL陽性細(xì)胞簇狀出現(xiàn),其陽性細(xì)胞積分光密度值高于Sham組,差異顯著(P0.05)。BMSCs組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)趨勢與ICH組類似,但積分光密度值與ICH組相比顯著降低(P0.05)。6腦組織含水量測定:Sham組腦組織含水量無明顯變化。ICH組與Sham組相比,在造模術(shù)后1,3和7天的腦組織含水量均顯著升高(P0.05)。BMSCs組大鼠1,3和7天的腦組織含水量均低于ICH組,差異顯著(P0.05)。7 ICH后神經(jīng)功能障礙的評估:ICH導(dǎo)致了大鼠嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。BMSCs組大鼠在術(shù)后第3,7和14天的前肢放置率、轉(zhuǎn)角率均顯著高于ICH組(P0.05),而NSS評分則顯著低于ICH組(P0.05)。小結(jié):BMSCs的原代培養(yǎng)、傳代和鑒定;采用注血法成功建立了大鼠ICH模型;大鼠ICH后血腫周圍腦組織受損,導(dǎo)致ICH大鼠神經(jīng)功能障礙;給予BMSCs移植治療后,可以發(fā)揮一定神經(jīng)保護(hù)作用,減輕血腫周圍腦組織受損程度,改善腦水腫和ICH大鼠神經(jīng)功能障礙情況。第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植通過PI3K-Akt-m TOR通路對腦出血大鼠自噬和軸突再生的影響目的:通過PI3K-Akt-m TOR通路抑制劑LY294002的干預(yù),探討大鼠ICH后BMSCs移植能否通過PI3K-Akt-m TOR通路影響受損腦組織內(nèi)的自噬和軸突再生。方法:102只雌性SD大鼠被隨機(jī)分為四組:1)假手術(shù)組(Sham group);2)腦出血組(ICH group);3)腦出血+BMSCs移植組(BMSCs group);4)腦出血+BMSCs移植+LY294002干預(yù)組(LY294002 group)。動物模型制作及BMSCs移植同第一部分,取術(shù)后12小時、1天、3天、7天、14天5個時間對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測:1)透射電鏡觀察大鼠ICH后受損腦組織超微結(jié)構(gòu),檢測自噬體;2)Western-blot檢測ICH后受損腦組織軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10,自噬相關(guān)蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表達(dá);3)免疫組化檢測受損腦組織內(nèi)GAP-43的表達(dá)及定位;4)免疫熒光觀察受損腦組織內(nèi)p-Akt和m TOR的共聚焦結(jié)果。實驗結(jié)果的測定記錄及統(tǒng)計分析同第一部分。結(jié)果:1透射電鏡結(jié)果:ICH造模術(shù)后3天,在皺縮的神經(jīng)細(xì)胞的胞核四周可以觀察到許多腫脹及變形的線粒體,此時亦有受損的線粒體及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)被雙層膜樣結(jié)構(gòu)所環(huán)繞,它們進(jìn)入溶酶體中并與之融合,最終形成了自噬溶酶體;2 p-Akt的免疫印跡分析結(jié)果:Sham組p-Akt蛋白低表達(dá)。ICH組大鼠受損腦組織內(nèi)p-Akt在造模手術(shù)后12小時升高,至3天達(dá)到峰值,之后逐漸降低,在各時間點p-Akt與Akt的比值都高于Sham組(P0.05)。BMSCs組p-Akt變化趨勢與ICH組類似,但各時間點p-Akt與Akt的比值進(jìn)一步升高(P0.05)。而LY294002組與BMSCs組相比p-Akt與Akt的比值降低,差異顯著(P0.05);3 p-Akt(紅色熒光)和m TOR(綠色熒光)的免疫熒光共聚焦結(jié)果:Sham組紅色和綠色熒光表達(dá)較少,重疊后可見少量的黃色聚集。ICH組造模后3天血腫周圍受損腦組織內(nèi)可見比Sham組中略強(qiáng)的紅色及綠色熒光,重疊后呈橘黃色。BMSCs組紅色及綠色熒光比ICH組更強(qiáng),重疊后橘黃色加重。而經(jīng)PI3K-Akt-m TOR通路抑制劑LY294002干預(yù)后,紅色及綠色熒光較BMSCs組明顯減弱,重疊后的橘黃色熒光亦減弱;4 LC3的免疫印跡分析結(jié)果:Sham組LC3II蛋白低表達(dá)。ICH組受損腦組織內(nèi)LC3II與LC3I的比值于術(shù)后12小時升高,3天達(dá)到峰值,之后降低但仍高于Sham組(P0.05)。BMSCs組LC3II與LC3I比值的變化趨勢與ICH組類似,但其表達(dá)量與ICH組相比較有進(jìn)一步升高,差異顯著(P0.05)。而與BMSCs組相比,LY294002干預(yù)能明顯降低LC3II與LC3I的比值(P0.05);5 p62的免疫印跡分析結(jié)果:Sham組p62的蛋白表達(dá)未見明顯差異。ICH組術(shù)后1天受損腦組織內(nèi)p62表達(dá)降低,3天達(dá)到最低值,雖然之后表達(dá)稍有升高,但仍低于Sham組,差異顯著(P0.05)。BMSCs組p62表達(dá)的趨勢類似ICH組,但其在各時間點的表達(dá)量均明顯低于ICH組(P0.05)。但LY294002干預(yù)后,p62的表達(dá)強(qiáng)度與BMSCs組相比明顯升高(P0.05);6 GAP-43免疫組化檢測結(jié)果:Sham組間或可見零星分布GAP-43的陽性細(xì)胞的表達(dá)。ICH組在術(shù)后1-7天可見GAP-43陽性細(xì)胞明顯增加,免疫反應(yīng)性與Sham組相比顯著增強(qiáng)(P0.05)。BMSCs組3-7天GAP-43陽性細(xì)胞的免疫反應(yīng)性與ICH組比較進(jìn)一步增強(qiáng),差異顯著(P0.05)。而LY294002干預(yù)導(dǎo)致GAP-43陽性細(xì)胞的免疫反應(yīng)性與BMSCs組相比明顯降低(P0.05);7 GAP-43的免疫印跡分析結(jié)果:Sham組GAP-43的蛋白表達(dá)未見明顯差異。ICH組造模術(shù)后3天受損腦組織GAP-43表達(dá)升高,雖然7天和14天GAP-43稍有降低,但仍高于Sham組,差異顯著(P0.05)。BMSCs組GAP-43的表達(dá)趨勢類似ICH組,但其在各時間點的表達(dá)量均進(jìn)一步升高(P0.05)。而LY294002干預(yù)后,GAP-43的表達(dá)強(qiáng)度與BMSCs組相比明顯降低(P0.05);8 SCG10的免疫印跡分析結(jié)果:Sham組SCG10的蛋白表達(dá)未見明顯差異。ICH組受損腦組織內(nèi)SCG10于造模術(shù)后12小時升高,3天達(dá)峰值,之后逐漸降低但仍高于Sham組(P0.05)。BMSCs組SCG10的表達(dá)趨勢與ICH組類似,但其在各時間點的表達(dá)量均降低,差異顯著(P0.05)。而LY294002干預(yù)后與BMSCs組相比能明顯提高SCG10的表達(dá)強(qiáng)度(P0.05)。小結(jié):ICH后血腫周圍受損腦組織內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞存在自噬和PI3K-Akt-m TOR通路的激活;給予BMSCs移植治療后,PI3K-Akt-m TOR通路進(jìn)一步激活,血腫周圍受損腦組織內(nèi)的自噬流增加,同時軸突再生增強(qiáng);而BMSCs移植對自噬流強(qiáng)度和軸突再生相關(guān)蛋白的表達(dá)均受PI3K-Akt-m TOR信號通路的調(diào)控。第三部分大鼠腦出血后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植通過自噬流介導(dǎo)軸突再生的機(jī)制研究目的:通過自噬抑制劑3MA和自噬激活劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)的干預(yù),明確大鼠ICH后BMSCs移植是否通過促進(jìn)血腫周圍受損腦組織內(nèi)的自噬流介導(dǎo)了軸突再生。方法:45只雌性SD大鼠被隨機(jī)分為五組:1)假手術(shù)組(Sham group);2)腦出血組(ICH group);3)腦出血+BMSCs移植組(BMSCs group);4)腦出血+BMSCs移植+3-MA干預(yù)組(3MA group);5)腦出血+BMSCs移植+RAPA干預(yù)組(RAPA group)。在術(shù)后3天對下列指標(biāo)進(jìn)行檢測:1)免疫熒光觀察受損腦組織內(nèi)LC3和不同細(xì)胞標(biāo)記物的共聚焦情況;2)Western-blot檢測ICH后受損腦組織軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10,自噬相關(guān)蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表達(dá);3)免疫組化檢測受損腦組織內(nèi)GAP-43的表達(dá)及定位。實驗結(jié)果的測定記錄及統(tǒng)計分析同第一部分。結(jié)果:1 LC3和細(xì)胞標(biāo)記物的免疫熒光共聚焦結(jié)果:紅色熒光標(biāo)記LC3,綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元,洋紅色熒光標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞,藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核。Sham組紅色熒光表達(dá)較少,能與綠色熒光重疊,可見少量的橘黃色聚集。ICH組受損腦組織內(nèi)胞漿中可見比Sham組多的紅色熒光,而綠色熒光明顯減少,重疊后呈橘黃色,提示ICH后神經(jīng)細(xì)胞自噬。同時洋紅色熒光要多于Sham組,提示ICH后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。BMSCs組紅色及綠色熒光均比ICH組更多,重疊后橘黃色加重,提示BMSCs移植治療進(jìn)一步激活了神經(jīng)細(xì)胞自噬,也減少了神經(jīng)細(xì)胞的死亡。同時洋紅色熒光少于ICH組,提示BMSCs能抑制ICH后的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。經(jīng)自噬抑制劑3MA干預(yù)后,與BMSCs組相比紅色熒光減少,而綠色熒光略減少,重疊后橘黃色亦減弱,洋紅色熒光無顯著變化。經(jīng)自噬激活劑RAPA干預(yù)后,與BMSCs組相比紅色熒光顯著增強(qiáng),而綠色熒光無顯著變化,重疊后橘黃色加重明顯,洋紅色熒光亦無顯著變化;2自噬相關(guān)蛋白LC3和p62的免疫印跡分析結(jié)果:ICH大鼠受損腦組織內(nèi)LC3II與LC3I比值顯著高于Sham組(P0.05),而p62表達(dá)顯著低于Sham組(P0.05),提示ICH后自噬流的激活。BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高LC3II與LC3I比值(P0.05),而p62表達(dá)量進(jìn)一步降低(P0.05),提示BMSCs能夠增強(qiáng)自噬流。當(dāng)給予自噬抑制劑3MA干預(yù)后,自噬被抑制,LC3II與LC3I比值降低(P0.05),而p62表達(dá)增強(qiáng)(P0.05)。自噬激活劑RAPA具有相反的作用,導(dǎo)致了LC3II與LC3I比值再一次升高(P0.05),p62表達(dá)則再一次降低(P0.05);3軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43和SCG10的免疫印跡分析結(jié)果:ICH大鼠受損腦組織內(nèi)GAP-43和SCG10表達(dá)均高于Sham組(P0.05)。BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高GAP-43的表達(dá)(P0.05),而SCG10表達(dá)降低(P0.05)。當(dāng)給予自噬抑制劑3MA干預(yù)后,GAP-43的表達(dá)降低(P0.05),而SCG10表達(dá)增強(qiáng)(P0.05)。自噬激活劑RAPA具有相反的作用,導(dǎo)致了GAP-43表達(dá)再次升高(P0.05),而SCG10表達(dá)則進(jìn)一步降低(P0.05);4 GAP-43的免疫組化檢測結(jié)果:Sham組可見零星分布的陽性細(xì)胞的表達(dá),著色很淡。ICH大鼠受損腦組織內(nèi)可見GAP-43陽性細(xì)胞明顯增加,著色亦加深,免疫反應(yīng)性與Sham組相比顯著增強(qiáng)(P0.05)。經(jīng)BMSCs移植治療后GAP-43陽性細(xì)胞進(jìn)一步增加,免疫反應(yīng)性進(jìn)一步增強(qiáng),差異顯著(P0.05)。自噬抑制劑3MA干預(yù)后,與BMSCs組比較GAP-43陽性細(xì)胞免疫性降低(P0.05),而自噬激活劑RAPA對GAP-43陽性細(xì)胞無顯著影響;5 p-Akt的免疫印跡分析結(jié)果:造模術(shù)后3天,ICH組p-Akt與Akt的比值顯著高于Sham組(P0.05),而BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步升高p-Akt與Akt的比值(P0.05)。然而,自噬抑制劑3MA和自噬激活劑RAPA對p-Akt與Akt的比值無顯著影響。小結(jié):大鼠ICH后BMSCs移植可通過增強(qiáng)受損腦組織內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的自噬流強(qiáng)度促進(jìn)軸突再生。結(jié)論:ICH后BMSCs移植能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,改善神經(jīng)功能障礙,其分子機(jī)制或許與激活的PI3K-Akt-m TOR通路促進(jìn)了受損腦組織內(nèi)自噬流介導(dǎo)的軸突再生有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34

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本文編號：2014753