本文選題：絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal + 1型　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是世界上常見且死亡率較高的腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織GLOBOCAN 2008數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),每年有748,300人次被檢測(cè)出罹患肝癌,男性的發(fā)病率超過女性的二倍以上,每年有695,900人次死于肝癌。中國(guó)每年的新發(fā)病例和死亡病例占到全球的一半以上,原發(fā)性肝癌是中國(guó)第二高發(fā)生率和死亡率的腫瘤。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌最主要的病理學(xué)類型,占到所有肝癌的75-80%。盡管外科手術(shù)切除和肝臟移植是治療肝癌的主要方法,但是仍然有75%的患者在術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移。這往往是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。因此,開展研究肝細(xì)胞癌的復(fù)查和轉(zhuǎn)移機(jī)制顯得十分重要。既往研究發(fā)現(xiàn),正常生理情況下,絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1)由胰腺的腺泡細(xì)胞分泌,起到抑制胰蛋白酶原過度激活,保護(hù)胰腺組織的作用。另一方面,SPINK1也是一種潛在的腫瘤標(biāo)志物,在卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)。血清中SPINK1過表達(dá)和腫瘤組織中SPINK1過表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后�；蚪M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在遺傳性血色素沉著相關(guān)的肝癌中SPINK1過度表達(dá)。SPINK1的結(jié)構(gòu)較表皮生長(zhǎng)因子(EGF)相似,有50%的同源性,與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)親和力是EGF的一半。因此,SPINK1被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到生長(zhǎng)因子的作用。所以,本文就SPINK1在肝癌進(jìn)程中所扮演的角色以及機(jī)制展開進(jìn)一步研究。目的:研究人肝細(xì)胞癌中SPINK1的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,探索SPINK1調(diào)控肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的分子機(jī)制。方法:1、臨床收集肝癌根治術(shù)患者的組織標(biāo)本80例,構(gòu)建組織芯片,免疫組化檢測(cè)人肝癌組織中SPINK1表達(dá)含量,根據(jù)染色強(qiáng)度以及染色面積進(jìn)行評(píng)分。結(jié)合臨床資料以及隨訪資料,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析肝癌患者肝癌組織中SPINK1表達(dá)量、血管侵犯、包膜完整度、腫瘤分化程度、TNM分期、單發(fā)/多發(fā)病灶間等之間的關(guān)系,探究SPINK1與肝細(xì)胞癌預(yù)后的相關(guān)性。2、構(gòu)建siRNA-SPINK1基因慢病毒載體,鑒定測(cè)序正確后,進(jìn)行病毒的包裝和滴度檢測(cè)并轉(zhuǎn)染MHCC97-H,MHCC97-L細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光含量,Western blotting鑒定轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞中SPINK1蛋白表達(dá)以及EMT標(biāo)志蛋白E-caherin、vimentin表達(dá)量。應(yīng)用Transwell(體外小室遷徙+侵襲)、劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞遷移和侵襲能力。3、將人重組SPINK1 蛋白(rSPINK1)10ng/ml加入MHCC97-H,MHCC97-L的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24小時(shí),觀察細(xì)胞形態(tài)變化,Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞SPINK1蛋白表達(dá)以及EMT標(biāo)志蛋白E-caherin及vimentin表達(dá)量。應(yīng)用Transwell(體外小室遷徙+侵襲)、劃痕實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞遷移和侵襲能力。4、檢測(cè)篩選信號(hào)通路:Western blotting檢測(cè)MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白MEK,p-MEK,ERK,p-ERK在以上各組細(xì)胞中表達(dá)的變化。5、信號(hào)通路抑制劑實(shí)驗(yàn):將U0126(MEK/ERK通路抑制劑)加入rSPINK1處理過的細(xì)胞中,Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)再次檢測(cè)細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移力,觀察U0126是否可以抑制了rSPINK1帶來的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)作用;Western blotting檢測(cè)相關(guān)通路的蛋白水平變化;結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)一步闡明SPINK1調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞遷移的機(jī)制。結(jié)果:1、肝癌組織中SPINK1的表達(dá)高低與肝癌病理分級(jí)、TNM分期、是否存在門脈癌栓的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPINK1高表達(dá)組的患者總生存時(shí)間低于低表達(dá)組,術(shù)后復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)組。SPINK1表達(dá)高低是肝癌患者總生存時(shí)間和術(shù)后復(fù)發(fā)率是一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。2、上調(diào)肝癌細(xì)胞SPINK1蛋白含量可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞由上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換(EMT),上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)水平下調(diào),間質(zhì)標(biāo)志物vimentin表達(dá)上調(diào),同時(shí)伴有肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力的增強(qiáng)。抑制肝癌細(xì)胞中SPINK1的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力,同時(shí)伴有E-Cadherin上調(diào),vimentin 下調(diào)。3、上調(diào)肝癌細(xì)胞中SPINK1含量激活MEK/ERK信號(hào)通路,抑制肝癌細(xì)胞中SPINK1的表達(dá)可以抑制MEK/ERK信號(hào)通路;加入U(xiǎn)0126抑制MEK/ERK通路激活,可以抑制SPINK1引起的EMT的相關(guān)標(biāo)志物蛋白含量改變以及對(duì)細(xì)胞侵襲遷移增強(qiáng)作用。結(jié)論:SPINK1高表達(dá)是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;SPINK1通過MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT,促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。
[Abstract]:Background: primary liver cancer is one of the most common and high mortality tumors in the world. According to the data of the WHO GLOBOCAN 2008, 748300 people have been detected each year with liver cancer, the incidence of men is more than two times more than that of women, and 695900 people die of liver cancer each year. New cases and deaths in China each year are accounted for. To more than half of the world, primary liver cancer is the second high incidence and mortality rate in China. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most important pathological type of primary liver cancer, which accounts for the 75-80%. of all liver cancer, although surgical resection and liver transplantation are the main methods for the treatment of liver cancer, but there are still 75% patients. The recurrence and / or metastasis of the patients within 5 years after the operation is a major factor leading to the death of the patients. Therefore, it is important to conduct a review and transfer mechanism of hepatocellular carcinoma. Previous studies have found that the serine protease inhibitor Kazal1 (serine protease inhibitor Kazal type 1, SPINK1) is from the pancreas under normal physiological conditions. Acinar cells are secreted to inhibit the overactivation of trypsinogen and protect pancreatic tissue. On the other hand, SPINK1 is also a potential tumor marker, expressed in ovarian, prostate, and colorectal cancer. SPINK1 overexpression in serum and SPINK1 overexpression in tumor tissues indicate poor prognosis. Genomics study The structure of SPINK1 overexpression of.SPINK1 in hereditary hemochromatosis related liver cancer was found to be similar to that of epidermal growth factor (EGF), with 50% homology and half of the epidermal growth factor receptor (EGFR) affinity as EGF. Therefore, SPINK1 was considered to play a role in the growth factor in the development of the tumor. Therefore, this article is on SPINK 1 the role and mechanism of the liver cancer process to be further studied. Objective: To study the relationship between the expression of SPINK1 and the prognosis in human hepatocellular carcinoma (HCC), and to explore the molecular mechanism of SPINK1 regulating the metastasis and invasion of hepatoma cells. Methods: 1, 80 tissue specimens were collected from the patients with radical hepatectomy, and the tissue microarray was constructed and the immunohistochemistry was used to detect people. The expression of SPINK1 in liver cancer tissue was evaluated according to the intensity and area of dyed. Combined with clinical data and follow-up data, the expression of SPINK1 expression, vascular invasion, envelope integrity, tumor differentiation, TNM phase, single / multiple lesions were analyzed by statistical methods. SPINK1 The correlation with the prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC).2, the siRNA-SPINK1 gene lentivirus vector was constructed and the sequencing was correctly identified. The virus packaging and titer detection were carried out and MHCC97-H, MHCC97-L cells, fluorescence microscopy were used to observe the fluorescence content of the cells. Western blotting was used to identify the expression of SPINK1 protein in the liver cancer cells before and after the transfection as well as the EMT marker protein E-ca. Herin, vimentin expression. Use Transwell (in vitro migration + invasion), scratch test method to detect cell cell migration and invasion ability.3, the recombinant SPINK1 protein (rSPINK1) 10ng/ml is added to MHCC97-H, MHCC97-L medium, culture for 24 hours, observe cell morphological changes, Western blotting detection of each group of cell SPINK1 protein Expression and expression of EMT marker protein E-caherin and vimentin. Use Transwell (in vitro migration + invasion), scratch test method to detect cell cell migration and invasion ability.4, and detect the screening signal pathway: Western blotting detection of MEK/ERK signaling pathway related proteins MEK, p-MEK, ERK, p-ERK in the above groups of cells expression of the changes .5, signal pathway inhibitor experiment: adding U0126 (MEK/ERK pathway inhibitor) into rSPINK1 treated cells, Transwell, scratch test to detect the invasiveness and transfer force of cells again, and observe whether U0126 can inhibit the enhancement of cell motility caused by rSPINK1; the protein of the Western blotting detection pathway In combination with the above experimental results, we further elucidate the mechanism of SPINK1 regulating the migration of hepatoma cells. Results: 1, the expression of SPINK1 in the liver cancer tissues and the pathological classification of liver cancer, TNM staging, and whether there is a significant difference between the portal vein tumor thrombus and the portal vein, the total survival time of the.SPINK1 high expression group is lower than that of the low expression group, and the postoperative recurrence rate is lower. Higher than low expression group.SPINK1 expression level is an independent risk factor.2 for the total survival time and postoperative recurrence rate of liver cancer patients. The up-regulation of SPINK1 protein content in hepatoma cells can promote the phenotype transformation of hepatoma cells from epithelial cells to interstitial cells (EMT), the level of E-Cadherin expression of epithelial markers, and the vimentin table of interstitial markers. The expression of SPINK1 in hepatoma cells can inhibit the metastasis and invasion of hepatoma cells, accompanied by up regulation of E-Cadherin, vimentin down.3, up regulation of SPINK1 content in hepatoma cells and the activation of MEK/ ERK signaling pathway to inhibit the expression of SPINK1 in hepatoma cells. The MEK/ERK signaling pathway can be inhibited and the activation of MEK/ERK pathway by adding U0126 can inhibit the changes in the protein content of the related markers of EMT induced by SPINK1 and the enhancement of cell invasion and migration. Conclusion: the high expression of SPINK1 is an independent risk factor affecting the prognosis of liver cancer; SPINK1 can induce hepatoma cells to be induced by MEK/ERK signal transduction pathway. EMT, which promotes the metastasis and invasion of hepatoma cells.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1994198