本文選題：絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal + 1型��； 參考：《南京醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌是世界上常見且死亡率較高的腫瘤之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織GLOBOCAN 2008數(shù)據(jù)統(tǒng)計,每年有748,300人次被檢測出罹患肝癌,男性的發(fā)病率超過女性的二倍以上,每年有695,900人次死于肝癌。中國每年的新發(fā)病例和死亡病例占到全球的一半以上,原發(fā)性肝癌是中國第二高發(fā)生率和死亡率的腫瘤。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌最主要的病理學類型,占到所有肝癌的75-80%。盡管外科手術切除和肝臟移植是治療肝癌的主要方法,但是仍然有75%的患者在術后5年內復發(fā)和/或轉移。這往往是導致患者死亡的主要因素。因此,開展研究肝細胞癌的復查和轉移機制顯得十分重要。既往研究發(fā)現(xiàn),正常生理情況下,絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1型(serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1)由胰腺的腺泡細胞分泌,起到抑制胰蛋白酶原過度激活,保護胰腺組織的作用。另一方面,SPINK1也是一種潛在的腫瘤標志物,在卵巢癌、前列腺癌、結直腸癌等腫瘤中表達。血清中SPINK1過表達和腫瘤組織中SPINK1過表達預示著不良預后�；蚪M學研究發(fā)現(xiàn)在遺傳性血色素沉著相關的肝癌中SPINK1過度表達。SPINK1的結構較表皮生長因子(EGF)相似,有50%的同源性,與表皮生長因子受體(EGFR)親和力是EGF的一半。因此,SPINK1被認為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起到生長因子的作用。所以,本文就SPINK1在肝癌進程中所扮演的角色以及機制展開進一步研究。目的:研究人肝細胞癌中SPINK1的表達與預后的關系,探索SPINK1調控肝癌細胞轉移侵襲的分子機制。方法:1、臨床收集肝癌根治術患者的組織標本80例,構建組織芯片,免疫組化檢測人肝癌組織中SPINK1表達含量,根據(jù)染色強度以及染色面積進行評分。結合臨床資料以及隨訪資料,用統(tǒng)計學方法分析肝癌患者肝癌組織中SPINK1表達量、血管侵犯、包膜完整度、腫瘤分化程度、TNM分期、單發(fā)/多發(fā)病灶間等之間的關系,探究SPINK1與肝細胞癌預后的相關性。2、構建siRNA-SPINK1基因慢病毒載體,鑒定測序正確后,進行病毒的包裝和滴度檢測并轉染MHCC97-H,MHCC97-L細胞,熒光顯微鏡觀察細胞熒光含量,Western blotting鑒定轉染前后肝癌細胞中SPINK1蛋白表達以及EMT標志蛋白E-caherin、vimentin表達量。應用Transwell(體外小室遷徙+侵襲)、劃痕實驗方法檢測各組細胞細胞遷移和侵襲能力。3、將人重組SPINK1 蛋白(rSPINK1)10ng/ml加入MHCC97-H,MHCC97-L的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24小時,觀察細胞形態(tài)變化,Western blotting檢測各組細胞SPINK1蛋白表達以及EMT標志蛋白E-caherin及vimentin表達量。應用Transwell(體外小室遷徙+侵襲)、劃痕實驗方法檢測各組細胞細胞遷移和侵襲能力。4、檢測篩選信號通路:Western blotting檢測MEK/ERK信號通路相關蛋白MEK,p-MEK,ERK,p-ERK在以上各組細胞中表達的變化。5、信號通路抑制劑實驗:將U0126(MEK/ERK通路抑制劑)加入rSPINK1處理過的細胞中,Transwell、劃痕實驗檢測再次檢測細胞的侵襲力和轉移力,觀察U0126是否可以抑制了rSPINK1帶來的細胞運動能力的增強作用;Western blotting檢測相關通路的蛋白水平變化;結合以上實驗結果,進一步闡明SPINK1調節(jié)肝癌細胞遷移的機制。結果:1、肝癌組織中SPINK1的表達高低與肝癌病理分級、TNM分期、是否存在門脈癌栓的差異有統(tǒng)計學意義。SPINK1高表達組的患者總生存時間低于低表達組,術后復發(fā)率高于低表達組。SPINK1表達高低是肝癌患者總生存時間和術后復發(fā)率是一個獨立風險因素。2、上調肝癌細胞SPINK1蛋白含量可以促進肝癌細胞由上皮細胞表型向間質細胞表型轉換(EMT),上皮標志物E-Cadherin表達水平下調,間質標志物vimentin表達上調,同時伴有肝癌細胞轉移能力和侵襲能力的增強。抑制肝癌細胞中SPINK1的表達可以抑制肝癌細胞的轉移和侵襲能力,同時伴有E-Cadherin上調,vimentin 下調。3、上調肝癌細胞中SPINK1含量激活MEK/ERK信號通路,抑制肝癌細胞中SPINK1的表達可以抑制MEK/ERK信號通路;加入U0126抑制MEK/ERK通路激活,可以抑制SPINK1引起的EMT的相關標志物蛋白含量改變以及對細胞侵襲遷移增強作用。結論:SPINK1高表達是影響肝癌預后的獨立危險因素;SPINK1通過MEK/ERK信號轉導途徑誘導肝癌細胞發(fā)生EMT,促進肝癌細胞轉移和侵襲。
[Abstract]:Background: primary liver cancer is one of the most common and high mortality tumors in the world. According to the data of the WHO GLOBOCAN 2008, 748300 people have been detected each year with liver cancer, the incidence of men is more than two times more than that of women, and 695900 people die of liver cancer each year. New cases and deaths in China each year are accounted for. To more than half of the world, primary liver cancer is the second high incidence and mortality rate in China. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most important pathological type of primary liver cancer, which accounts for the 75-80%. of all liver cancer, although surgical resection and liver transplantation are the main methods for the treatment of liver cancer, but there are still 75% patients. The recurrence and / or metastasis of the patients within 5 years after the operation is a major factor leading to the death of the patients. Therefore, it is important to conduct a review and transfer mechanism of hepatocellular carcinoma. Previous studies have found that the serine protease inhibitor Kazal1 (serine protease inhibitor Kazal type 1, SPINK1) is from the pancreas under normal physiological conditions. Acinar cells are secreted to inhibit the overactivation of trypsinogen and protect pancreatic tissue. On the other hand, SPINK1 is also a potential tumor marker, expressed in ovarian, prostate, and colorectal cancer. SPINK1 overexpression in serum and SPINK1 overexpression in tumor tissues indicate poor prognosis. Genomics study The structure of SPINK1 overexpression of.SPINK1 in hereditary hemochromatosis related liver cancer was found to be similar to that of epidermal growth factor (EGF), with 50% homology and half of the epidermal growth factor receptor (EGFR) affinity as EGF. Therefore, SPINK1 was considered to play a role in the growth factor in the development of the tumor. Therefore, this article is on SPINK 1 the role and mechanism of the liver cancer process to be further studied. Objective: To study the relationship between the expression of SPINK1 and the prognosis in human hepatocellular carcinoma (HCC), and to explore the molecular mechanism of SPINK1 regulating the metastasis and invasion of hepatoma cells. Methods: 1, 80 tissue specimens were collected from the patients with radical hepatectomy, and the tissue microarray was constructed and the immunohistochemistry was used to detect people. The expression of SPINK1 in liver cancer tissue was evaluated according to the intensity and area of dyed. Combined with clinical data and follow-up data, the expression of SPINK1 expression, vascular invasion, envelope integrity, tumor differentiation, TNM phase, single / multiple lesions were analyzed by statistical methods. SPINK1 The correlation with the prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC).2, the siRNA-SPINK1 gene lentivirus vector was constructed and the sequencing was correctly identified. The virus packaging and titer detection were carried out and MHCC97-H, MHCC97-L cells, fluorescence microscopy were used to observe the fluorescence content of the cells. Western blotting was used to identify the expression of SPINK1 protein in the liver cancer cells before and after the transfection as well as the EMT marker protein E-ca. Herin, vimentin expression. Use Transwell (in vitro migration + invasion), scratch test method to detect cell cell migration and invasion ability.3, the recombinant SPINK1 protein (rSPINK1) 10ng/ml is added to MHCC97-H, MHCC97-L medium, culture for 24 hours, observe cell morphological changes, Western blotting detection of each group of cell SPINK1 protein Expression and expression of EMT marker protein E-caherin and vimentin. Use Transwell (in vitro migration + invasion), scratch test method to detect cell cell migration and invasion ability.4, and detect the screening signal pathway: Western blotting detection of MEK/ERK signaling pathway related proteins MEK, p-MEK, ERK, p-ERK in the above groups of cells expression of the changes .5, signal pathway inhibitor experiment: adding U0126 (MEK/ERK pathway inhibitor) into rSPINK1 treated cells, Transwell, scratch test to detect the invasiveness and transfer force of cells again, and observe whether U0126 can inhibit the enhancement of cell motility caused by rSPINK1; the protein of the Western blotting detection pathway In combination with the above experimental results, we further elucidate the mechanism of SPINK1 regulating the migration of hepatoma cells. Results: 1, the expression of SPINK1 in the liver cancer tissues and the pathological classification of liver cancer, TNM staging, and whether there is a significant difference between the portal vein tumor thrombus and the portal vein, the total survival time of the.SPINK1 high expression group is lower than that of the low expression group, and the postoperative recurrence rate is lower. Higher than low expression group.SPINK1 expression level is an independent risk factor.2 for the total survival time and postoperative recurrence rate of liver cancer patients. The up-regulation of SPINK1 protein content in hepatoma cells can promote the phenotype transformation of hepatoma cells from epithelial cells to interstitial cells (EMT), the level of E-Cadherin expression of epithelial markers, and the vimentin table of interstitial markers. The expression of SPINK1 in hepatoma cells can inhibit the metastasis and invasion of hepatoma cells, accompanied by up regulation of E-Cadherin, vimentin down.3, up regulation of SPINK1 content in hepatoma cells and the activation of MEK/ ERK signaling pathway to inhibit the expression of SPINK1 in hepatoma cells. The MEK/ERK signaling pathway can be inhibited and the activation of MEK/ERK pathway by adding U0126 can inhibit the changes in the protein content of the related markers of EMT induced by SPINK1 and the enhancement of cell invasion and migration. Conclusion: the high expression of SPINK1 is an independent risk factor affecting the prognosis of liver cancer; SPINK1 can induce hepatoma cells to be induced by MEK/ERK signal transduction pathway. EMT, which promotes the metastasis and invasion of hepatoma cells.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1994198