發(fā)布時間：2018-05-16 20:23

  本文選題：碳納米材料 + 光聲成像��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：乳腺癌是以淋巴系統(tǒng)作為首要轉(zhuǎn)移途徑,因而有效殺滅或抑制淋巴系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)移腫瘤細胞是乳腺癌預后的決定性因素之一,對提高乳腺癌的總體生存率具有重要意義。由于乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在腋窩、胸肌間及內(nèi)乳淋巴結(jié)多條轉(zhuǎn)移路徑,且可呈跳躍式轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移,故在傳統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術的過程中難免會遺漏已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞,最終導致乳腺癌局部復發(fā),影響患者預后及生存。雖然目前臨床常規(guī)采用新輔助化療,但是這種全身化療方式能進入淋巴系統(tǒng)的藥物量極低,仍然導致部分腫瘤細胞不能得到有效的殺傷。因此,研究者們?nèi)栽趯で笠环N有效的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療方案。在近年來對腫瘤治療的研究中,光熱治療(photothermal therapy,PTT)是一種新興的治療手段。光熱治療利用激光照射光熱轉(zhuǎn)換材料使局部溫度升高來殺傷腫瘤細胞,相比傳統(tǒng)的放療和化療,光熱治療以其局部精準微創(chuàng)、對正常組織無損傷等優(yōu)勢,在腫瘤治療中受到了越來越多的關注。光熱治療的關鍵在于光熱轉(zhuǎn)換材料的性能,一般考慮的因素主要有生物相容性良好、光熱轉(zhuǎn)換效率高、光穩(wěn)定性好。隨著研究的深入,光熱轉(zhuǎn)換材料的設計也正在向著可視化、多功能化發(fā)展,結(jié)合影像手段實現(xiàn)可視化治療也已經(jīng)成為光熱治療的研究熱點之一。光聲成像技術是利用光能轉(zhuǎn)化為超聲能的特征,實行體內(nèi)無創(chuàng)性成像的一種新的臨床前技術,它克服了光學成像的“軟極限(1mm)”,可以檢測到體內(nèi)深達5cm的病灶,且具有很高的空間分辨率,在探測深度明顯加深的同時能保持較高的對比度。光聲成像與光熱治療相結(jié)合,不僅可以作為可視化手段監(jiān)測光熱轉(zhuǎn)換材料的分布情況,還可以精確定位引導光熱治療,這為乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)光熱治療的精準性提供了重要的依據(jù)。目前乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的臨床治療中,由于患者存在臨床分期和自身情況的差異,傳統(tǒng)、單一的療法往往并不能徹底抑制轉(zhuǎn)移,乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療方法正向著多元化的方向發(fā)展。因此,在結(jié)合影像手段之外,光熱治療應進一步結(jié)合靶向化療,從而更有希望徹底解決乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療問題。淋巴結(jié)靶向化療,是利用淋巴系統(tǒng)具有吞噬大分子物質(zhì)的特性,將化療藥物與載體相結(jié)合,經(jīng)局部注射給藥進入淋巴系統(tǒng),使淋巴系統(tǒng)內(nèi)較長時間保持高濃度的化療藥物,從而有效殺傷淋巴系統(tǒng)內(nèi)的腫瘤細胞,而且藥物不進入血循環(huán),大大降低了副作用,現(xiàn)己在胃癌、乳腺癌等腫瘤治療中得到了廣泛應用。淋巴靶向化療的關鍵是化療藥物的載體,其應具有淋巴結(jié)趨向性、超強吸附能力和定位釋放能力。醫(yī)學納米材料作為科技前沿技術之一,在個體化“精準醫(yī)療”呼聲越來越強的時代應運而生,近年來,納米材料因其物理、化學、生物學方面的獨特性質(zhì)而逐漸成為研究的熱點。因此,我們立足于尋找一種全新的、單體材料固有的,既具有良好的光聲成像特性,又具有高效的光熱轉(zhuǎn)換效率,同時還能攜帶靶向化療藥物的一體化多功能納米材料,以實現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的精準治療,降低局部復發(fā)率、提高患者生存質(zhì)量。碳納米材料是分散相尺度至少有一維小于100 nm的碳材料,具有獨特的光學、電學、熱學和機械學等性質(zhì),近年來碳納米材料在腫瘤光熱治療和藥物傳遞領域的研究層出不窮。納米炭也是一種碳納米材料,具有良好的淋巴結(jié)趨向性和對藥物的高吸附性,已有研究者將其應用于乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的靶向化療,但其應用于光熱治療尚未見報道。因此,本研究首先比較了在特定波長(808nm)下三種不同結(jié)構(gòu)碳納米材料的光聲效應和光熱性能,證明了納米炭具有良好的光聲成像性質(zhì)和光熱轉(zhuǎn)換性能;然后利用可生物降解的高分子材料-乳酸/羥基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)作為成膜材料,制備出包裹納米炭和液態(tài)氟碳(liquid perfluorohexane,PFH)的碳納米粒,在激光輻照下可同時進行光聲顯像和光熱治療;最后利用納米炭的高吸附性,攜載抗腫瘤藥物-多西紫杉醇制備出多功能納米粒,在光聲顯像和光熱治療的基礎上,液態(tài)氟碳產(chǎn)生液-氣相變促使其破裂、藥物定位釋放從而實現(xiàn)靶向化療,以此為乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的影像示蹤、定位引導、聯(lián)合治療提供一種新思路和新方法。第一部分在特定波長下評價不同結(jié)構(gòu)碳納米材料的光聲效應與光熱性能目的探討不同結(jié)構(gòu)碳納米材料在特定波長下的光聲效應與光熱性能。方法將氧化石墨烯、多壁碳納米管、納米炭配制成不同濃度的混懸液,在808nm波長下用光聲儀觀察其光聲成像效果并測量光聲值,用波長為808nm、不同能量的激光輻照,紅外熱像儀監(jiān)測溫度變化;以金納米棒作為對照,激光輻照30s后關閉激光,待恢復至室溫后再次輻照,反復輻照5次,繪制溫度變化曲線。結(jié)果三種碳納米材料在808nm波長下均能進行光聲成像和光熱轉(zhuǎn)換,其中多壁碳納米管和納米炭的光聲成像效果和光熱轉(zhuǎn)換能力較氧化石墨烯強,經(jīng)激光輻照后均能使溫度升高至50℃;而且樣品濃度越高、激光能量越強,溫度升高越快。碳納米材料經(jīng)5次輻照后的最高溫度均維持在第一次升高的溫度,而金納米棒經(jīng)5次輻照后溫度僅上升了約10℃。結(jié)論不同結(jié)構(gòu)碳納米材料在808nm波長下均有不同程度的光聲效應與光熱性能,其中多壁碳納米管和納米炭的光聲效應與光熱性能較氧化石墨烯強;碳納米材料具有良好的光熱穩(wěn)定性。第二部分碳納米粒對乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的可視化光熱治療目的制備一種載納米炭和液態(tài)氟碳的碳納米粒(CNPs),檢測其物理特性,觀察其光聲效應和光熱性能,并探討其在激光輻照下對乳腺癌MDA-MB-231細胞的殺傷作用及對兔VX2腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。方法采用雙乳化法制備CNPs,光學顯微鏡、透射電鏡觀察形態(tài)、大小、表面及內(nèi)部,激光粒徑儀檢測粒徑大小及分布,表面電位儀檢測Zeta電位,紫外分光光度法測定上清液和CNPs中納米炭的濃度,計算包封率和載藥量;用波長為808nm的光聲儀觀察其光聲成像效果并測量光聲值;用波長為808nm、不同能量的激光輻照,并用紅外熱像儀觀察溫度變化情況,繪制溫度變化曲線,選擇溫度能維持在約45-50℃的激光能量進行細胞實驗。培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞,在培養(yǎng)基中加入載熒光染料的CNPs,6h、12h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察CNPs的細胞吞噬情況;在培養(yǎng)基中加入CNPs,培養(yǎng)12h后予以1.0 W/cm2激光輻照0、1、2、4min,繼續(xù)培養(yǎng)12h后Annexin V/FITC流式細胞術檢測細胞凋亡率。建立離體實驗模型,在距離皮下約1.0、2.0、3.0、4.0cm處,用不同能量的激光輻照,通過紅外熱像儀觀察溫度變化情況,繪制溫度變化曲線,選擇溫度能維持在約45-50℃的激光能量進行動物實驗。建立兔VX2腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型,分為3組:納米炭組(CNs)、空白納米粒組(NPs)、碳納米粒組(CNPs),各組分別經(jīng)足底注射納米炭、空白納米粒、碳納米粒,24h后光聲儀觀察其在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的分布情況,808nm、1.5W/cm2激光輻照,紅外熱像儀觀察局部溫度變化情況。各組于治療前及治療4w后經(jīng)二維超聲成像測量淋巴結(jié)大小并計算體積、彩色多普勒血流成像觀察血流多少并分級,彈性成像觀察軟硬程度并測量彈性值;治療4w后取出淋巴結(jié),HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移及細胞壞死情況,TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù),免疫組化法觀察Ki-67、CD44v6、E-Cadherin的表達水平。結(jié)果本研究制備的CNPs外觀呈黑色乳液,光鏡和電鏡下觀察呈球形,大小均一,表面光滑,分散均勻;激光粒徑儀測得其平均粒徑大小為(452.7±23.6)nm,表面電位儀測得其Zeta電位為-(20.8±1.6)m V;紫外分光光度法測定上清液和CNPs中納米炭的濃度,分別得到的包封率為(51.98±2.86)%、(52.50±3.22)%,載藥量分別為(2.95±0.12)%、(2.83±0.16)%;其光聲成像效果良好,光聲值為6.92±1.45;其光熱轉(zhuǎn)換效率高,在1.0W/cm2的激光輻照下溫度迅速升高并維持在約45-50℃。激光共聚焦顯微鏡觀察到,CNPs能夠被乳腺癌MDA-MB-231細胞吞噬,且具有時間依賴性。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,CNPs經(jīng)激光輻照后可對乳腺癌細胞產(chǎn)生殺傷作用,且輻照時間越長、殺傷作用越大。離體實驗表明,CNPs與體表的距離對其光熱轉(zhuǎn)換效率影響較大,≤2.0cm CNPs的光熱轉(zhuǎn)換效率高,在1.5W/cm2的激光輻照下溫度迅速升高并維持在約45-50℃,2.0cm其光熱轉(zhuǎn)換效率明顯降低。CNPs能夠?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行光聲顯像并經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有一定的治療作用,治療4w后NPs組的淋巴結(jié)體積較治療前增大,CNs組和CNPs組的淋巴結(jié)體積較治療前略減小,但血流明顯減少且彈性值減低;HE染色觀察到CNs組和CNPs組的淋巴結(jié)內(nèi)有較多細胞壞死,但部分淋巴結(jié)內(nèi)仍可見殘余腫瘤細胞;TUNEL法顯示CNs組和CNPs組的細胞凋亡指數(shù)較NPs組高;免疫組化顯示CNs組和CNPs組的壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色,存活腫瘤細胞Ki-67呈低表達、CD44v6呈陰性表達、E-Cadherin呈陽性表達,而NPs組的腫瘤細胞Ki-67呈高表達,CD44v6呈陽性表達,E-Cadherin呈陰性表達。結(jié)論雙乳化法能成功制備CNPs,其體外的光聲效應和光熱性能良好,經(jīng)激光輻照后對乳腺癌MDA-MB-231細胞有明顯的殺傷作用,其體內(nèi)的光聲效應亦良好,經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有一定的治療作用,但其光熱轉(zhuǎn)換效率隨距離的增大有所下降。第三部分多功能納米粒對乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可視化光熱治療與靶向化療目的制備一種多功能納米粒(DOC-CNPs),檢測其物理特性,觀察其光聲成像效果、光熱轉(zhuǎn)換性能和藥物釋放能力,并探討其在激光輻照下對乳腺癌MDA-MB-231細胞的殺傷作用及對兔VX2腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。方法采用雙乳化法制備DOC-CNPs,光學顯微鏡、透射電鏡觀察形態(tài)、大小、表面及內(nèi)部,激光粒徑儀檢測粒徑大小及分布,表面電位儀檢測Zeta電位,光聲儀觀察其光聲成像效果;激光輻照并用紅外熱像儀觀察溫度變化情況;高效液相色譜法測定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的濃度,計算包封率和載藥量;將DOC-CNPs裝入透析袋中,用1.0W/cm2的激光輻照后,于不同時間點取樣,高效液相色譜法測定多西紫杉醇的濃度,計算各時間點累積釋放率,繪制藥物釋放時間曲線。培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞,將細胞分為4組:對照組(CT)、DOC-CNPs組(DC)、激光輻照組(LA)、DOC-CNPs與激光輻照組(DC+LA),CT組不予任何處理,DC組、DC+LA組加入DOC-CNPs,LA組、DC+LA組予以1.0W/cm2激光輻照4min,各組細胞處理后經(jīng)Annexin V/FITC流式細胞術檢測細胞凋亡率。建立兔VX2腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型,同樣分為4組:CT組不予任何處理,DC組、DC+LA組經(jīng)足墊注射DOC-CNPs,24h后用光聲儀觀察DOC-CNPs在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的分布情況,LA組、DC+LA組每天予以1.5 W/cm2激光輻照10min。各組于治療前及治療4w后經(jīng)超聲成像監(jiān)測淋巴結(jié)的大小、血流及硬度;治療4w后取出淋巴結(jié),HE染色觀察腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及壞死情況,TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù),免疫組化法觀察Ki-67、CD44v6、E-Cadherin的表達水平。結(jié)果本研究制備的DOC-CNPs外觀呈黑色乳液,光鏡和電鏡下觀察呈球形,大小均一,表面光滑,分散均勻;激光粒徑儀測得其平均粒徑大小為(463.7±25.2)nm,表面電位儀測得其Zeta電位為-(22.6±1.2)m V,且其光聲成像效果良好、光熱轉(zhuǎn)換效率高;高效液相色譜法測定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的濃度,計算得到的包封率分別為(63.85±2.41)%、(64.16±1.87)%,載藥量分別為(10.08±0.39)%、(9.83±0.42)%;經(jīng)1.0W/cm2的激光輻照后DOC-CNPs的藥物累積釋放率隨時間延長不斷升高,而對照組較低。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,DC+LA組細胞凋亡率明顯高于其余各組。DOC-CNPs能夠?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行光聲顯像并經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有良好的治療作用,治療4w后CT組、LA組的淋巴結(jié)體積較治療前增大,DC+LA組的淋巴結(jié)體積較治療前明顯減小,且血流信號明顯減少、彈性值明顯減低;HE染色觀察到DC+LA組的淋巴結(jié)內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤細胞壞死,DC組可見部分腫瘤細胞壞死;TUNEL法顯示DC+LA組的細胞凋亡指數(shù)較其余各組高;免疫組化顯示CT組和LA組腫瘤細胞Ki-67呈高表達,CD44v6呈陽性表達,E-Cadherin呈陰性表達,DC組可見部分壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色,而DC+LA組大量壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色。結(jié)論雙乳化法能成功制備DOC-CNPs,其光聲效應、光熱性能和載藥能力良好,經(jīng)激光輻照后對乳腺癌MDA-MB-231細胞有顯著的殺傷作用,對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有顯著的治療效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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本文編號：1898266