本文選題：肝星狀細胞 + PVT1�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:肝纖維化主要特征為肝臟內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積。肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)是肝主要的ECM產(chǎn)生細胞,其活化過程被視為肝纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。近來研究顯示Hedgehog(Hh)調(diào)控的內(nèi)皮間葉化進程(EMT)參與HSC活化。以往視為“噪音”的長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)現(xiàn)已被證實與多種疾病相關且能調(diào)節(jié)基因功能。漿細胞瘤變異易位1(Plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)是一個腫瘤相關lncRNA,但其在肝纖維化中的作用尚不清楚。本研究目的是探索PVT1在肝纖維化中的表達改變、功能及其相關分子機制。方法:四氯化碳(CC14)誘導的小鼠肝纖維化模型接受重組腺病毒Ad-shPVT1或丹酚酸B(SalvianolicacidB,SalB)的治療并檢測肝臟膠原量的改變。原代HSCs接受PVT1 siRNA或Sal B處理后檢測增殖和膠原改變。實時熒光定量PCR和Western blot分別檢測EMT、Hedgehog信號及其它相關基因mRNA和蛋白改變。亞硫酸氫鹽測序法用于分析PTCH1啟動子甲基化。熒光素報告基團及Pull down實驗驗證PVT1和microRNA-152(miR-152)間是否存在關聯(lián)。結(jié)果:與對照組相比,PVT1在纖維化肝組織和活化的HSCs中表達升高。在HSCs中,沉默PVT1有效抑制HSC活化包括增殖和膠原蛋白的下降;體內(nèi)PVT1的減少也能抑制CC14誘導的I型膠原。PVT1下降引起EMT進程的阻滯,伴有E-cadherin的上調(diào)和desmin及vimentin的下調(diào)。PVT1下降也抑制了Hedgehog信號,伴有PTCH1的上調(diào)和SMO及GLI2的下調(diào)。此外,我們的研究表明Sal B也有良好的體內(nèi)外抗肝纖維化療效。在Sal B處理后的HSCs中,我們再次確證了 Hedgehog信號下降會伴有EMT進程阻滯。研究發(fā)現(xiàn)作為Hedgehog信號負向調(diào)控因子的PTCH1,其啟動子在肝纖維化進展時會高度甲基化。Sal B能抑制PTCH1的甲基化并恢復其表達水平。深入研究證實靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1的miR-152調(diào)控PTCH1甲基化進程。我們發(fā)現(xiàn)PVT1下調(diào)不僅抑制體內(nèi)外PCTH1的甲基化還伴有miR-152的升高。值得注意的是,下降的細胞增殖和膠原表達以及增強的PTCH1去甲基化和PTCH1表達水平,這些PVT1下調(diào)所帶來的效應均被miR-152抑制劑所阻斷。熒光素報告基團實驗證實PVT1與miR-152間存在靶向關系。Pull down實驗也證實PVT1能夠直接結(jié)合miR-152。此外,在Sal B處理后的HSCs中沉默PVT1能增強Sal B對細胞增殖和膠原的抑制作用。結(jié)論:PVT1在CC14誘導后的纖維化肝組織和活化的HSCs中表達均上調(diào),而PVT1下調(diào)后則表現(xiàn)出體內(nèi)外抗纖維化效果。我們證實PVT1通過競爭性結(jié)合miR-152繼而表觀性抑制PTCH1表達,從而促進肝纖維化中Hedgehog信號活化和EMT發(fā)展。本研究表明了 PVT1/miR-152/PTCH1這一新穎的信號通路存在于肝纖維化中且Sal B能通過該信號發(fā)揮抗纖維化作用。
[Abstract]:Background and purpose: liver fibrosis is mainly characterized by excessive deposition of extracellular matrix (ECM) in the liver. Hepatic stellate cell (HSC) is the major ECM producing cell of the liver, and its activation process is considered as a key link in liver fibrosis. Recent studies have shown that Hedgehog (Hh) Regulation of endothelial foliage has been shown. EMT (Long non-coding RNAs, lncRNAs), formerly known as "noise", has been confirmed to be associated with a variety of diseases and can regulate gene function. The mutation translocation 1 (Plasmacytoma variant translocation 1, PVT1) of plasma cell tumor (Plasmacytoma variant translocation 1, PVT1) is a tumor associated lncRNA, but its role in liver fibrosis is not clear. The aim of this study was to explore the expression changes, functions and related molecular mechanisms of PVT1 in liver fibrosis. Methods: the mice liver fibrosis model induced by carbon tetrachloride (CC14) accepted the treatment of recombinant adenovirus Ad-shPVT1 or salvianolic acid B (SalvianolicacidB, SalB) and the changes in the liver collagen content. The original HSCs accepted PVT1 siRNA or Sal B. After treatment, the proliferation and collagen changes were detected. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to detect EMT, Hedgehog signal and other related genes mRNA and protein changes. The hydrogen sulfite sequencing method was used to analyze PTCH1 promoter methylation. The fluorescein report group and Pull down experiment verified whether there was any association between PVT1 and microRNA-152 (miR-152). Results: compared with the control group, the expression of PVT1 increased in the fibrosis liver tissue and activated HSCs. In HSCs, the silence of PVT1 effectively inhibited the activation of HSC, including the decrease of proliferation and collagen, and the decrease of PVT1 in the body could inhibit the CC14 induced I type collagen.PVT1 decrease to block the EMT process, accompanied by E-cadherin up and desmin. The downregulation of.PVT1 also inhibited the Hedgehog signal, with the up-regulation of PTCH1 and the downregulation of SMO and GLI2. In addition, our study showed that Sal B also had a good therapeutic effect on liver fibrosis. In HSCs after Sal B, we confirmed that Hedgehog signal decline would be accompanied by EMT process block. To the regulatory factor PTCH1, its promoter highly methylation.Sal B can inhibit the methylation of PTCH1 and restore its expression level when liver fibrosis progresses. Further studies have confirmed that the miR-152 targeting DNA methyltransferase 1 regulates the process of PTCH1 methylation. We found that the down regulation of PVT1 not only inhibits the methylation of PCTH1 in and out of the body, but also is associated with miR-152. It is worth noting that decreased cell proliferation and collagen expression as well as enhanced PTCH1 demethylation and PTCH1 expression levels, the effects of these down-regulation were blocked by miR-152 inhibitors. The fluorescein report group experiment confirmed the existence of the targeting relationship between PVT1 and miR-152,.Pull down experiment also confirmed that PVT1 can be directly combined with miR-15. 2. in addition, the silencing of PVT1 in HSCs treated with Sal B enhanced the inhibitory effect of Sal B on cell proliferation and collagen. Conclusion: the expression of PVT1 in the fibrosis liver tissues and activated HSCs after CC14 induction is up, and the down regulation of PVT1 shows the effect of anti fibrosis in vivo and in vivo. Inhibiting the expression of PTCH1 and promoting the activation of Hedgehog signal and the development of EMT in liver fibrosis. This study shows that the novel signal pathway of PVT1/miR-152/PTCH1 exists in liver fibrosis and Sal B can play anti fibrosis effect through the signal.

【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R575.2

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