本文選題：棘球蚴 + 蛋白質(zhì)組�。� 參考：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目的:棘球蚴病,又稱為包蟲病,是由棘球絳蟲幼蟲寄生于人體及綿羊等中間宿主體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病,呈世界性分布。在我國人體包蟲病主要有兩種類型,即由細(xì)粒棘球絳蟲(Eg)引起的囊型包蟲病(CE)和由多房棘球絳蟲(Em)引起的泡型包蟲病(AE)。兩型包蟲病危害嚴(yán)重,防治研究刻不容緩。本研究旨在:(1)建立更加穩(wěn)定的Eg、Em體外成囊培養(yǎng)系統(tǒng),為棘球絳蟲的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究及抗棘球蚴藥物的篩選和疫苗的研制提供實驗材料;(2)通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法,對體外成囊培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的囊液進(jìn)行蛋白質(zhì)組深度測序,確定離體正常發(fā)育包囊囊液中分泌蛋白表達(dá)譜,篩選出可能對宿主免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用的分泌蛋白;(3)探討棘球蚴主要的分泌蛋白之一抗氧化蛋白EgTPx對宿主巨噬細(xì)胞極化方式的調(diào)節(jié)及在棘球蚴感染早期中免疫逃避機制的作用。(4)研究Eg感染對過敏性哮喘減輕或抑制的可能作用機制,為利用蠕蟲的免疫調(diào)控機制開辟新的自身免疫性疾病及及過敏性疾病的防治策略提供重要依據(jù)。方法:(1)分別從屠宰場自然感染Eg的綿羊肝臟及實驗室Em保種的灰倉鼠病灶中采集新鮮原頭蚴(PSC),經(jīng)1%的胃蛋白酶消化后檢測蟲體活性并計數(shù),于37℃、5%CO2條件下體外培養(yǎng),在培養(yǎng)的不同時間點隨機取適量樣品于倒置顯微鏡下觀察、拍照并記錄原頭蚴生長發(fā)育情況,通過透射電子顯微鏡觀察培養(yǎng)囊泡的超微結(jié)構(gòu);分別將體外培養(yǎng)獲得的Eg和Em微囊以每鼠50個微囊的劑量,通過腹腔注射的方法分別接種BALB/c小鼠,并對接種感染獲得的包蟲囊進(jìn)行計數(shù)和HE染色,計算感染率和成囊率。(2)分別收集來自體外培養(yǎng)的eg和em囊泡中的囊液,經(jīng)真空冷凍干燥、定量、酶解和scx分離后,采用基于tripletof5600的lc-esi-msms分析系統(tǒng)和蛋白數(shù)據(jù)庫(eg_proteins.fa和em_proteins.fa以及牛血清庫uniprot_bovine_serum.fa)進(jìn)行囊液中蛋白表達(dá)譜的鑒定和生物信息學(xué)分析,并使用signaip,tmhmm,targetp軟件對鑒定到的蛋白進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測分析。(3)通過體外培養(yǎng)psc,利用rnai技術(shù)沉默egtpx基因的表達(dá),確定egtpx對細(xì)粒棘球蚴正常生長存活的必要性;通過rt-pcr方法克隆egtpx基因,通過點突變的方法構(gòu)建其突變體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)egtpx及其突變體蛋白,通過保護(hù)超螺旋dna實驗及還原劑dtt實驗鑒定其生物學(xué)功能;采用貼壁法分離純化感染eg和em微囊的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,使用巨噬細(xì)胞的特異性引物(inos、ym1、fizz1、arginase1)pcr擴增鑒定巨噬細(xì)胞極化類型;通過m-csf體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞,分別添加lps、il-4、囊液抗原、重組蛋白egtpx及其突變體蛋白進(jìn)行刺激,收集細(xì)胞提取rna,使用巨噬細(xì)胞的特異性引物進(jìn)行pcr擴增鑒定巨噬細(xì)胞極化類型。(4)采用卵清白蛋白(ova)致敏和激發(fā)小鼠建立細(xì)粒棘球蚴感染并發(fā)過敏性哮喘實驗動物模型,通過小鼠無創(chuàng)肺功能檢測儀檢測小鼠氣道高反應(yīng);he及pas染色觀察肺組織病理切片炎癥細(xì)胞浸潤程度;通過rt-qpcr、wb以及流式檢測肺組織、血液、脾臟中th1/th2/th17/treg相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化,探討細(xì)粒棘球蚴感染是否對過敏性哮喘氣道炎癥具有減輕或抑制作用,并分析其可能的作用機制。結(jié)果:(1)eg和em原頭蚴在體外培養(yǎng)15天時微囊逐漸形成,60天時包囊具有透明角質(zhì)層結(jié)構(gòu),100天后形成肉眼可見的較大囊泡,超微結(jié)構(gòu)顯示eg囊泡外部有較厚的無細(xì)胞薄片層,而em囊泡薄片層較薄,生發(fā)層細(xì)胞較為豐富,并可見生發(fā)囊及囊內(nèi)原頭蚴產(chǎn)生。微囊接種小鼠感染率均為100%,eg包蟲囊為游離單囊,成囊率達(dá)70%,囊內(nèi)無psc產(chǎn)生。em包蟲囊為似腫瘤狀的團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu),有生發(fā)囊及原頭蚴產(chǎn)生。(2)sds-page顯示eg和em囊液蛋白主要集中在1-100kda之間,采用lc-ms/ms分別鑒定得到774個eg蛋白,2305個em蛋白和39個牛血清相關(guān)蛋白。其中,eg經(jīng)典型分泌蛋白有52個,em有122個,主要包括抗原b的不同亞型。經(jīng)go功能注釋發(fā)現(xiàn)eg和em囊液蛋白所參與的生物過程主要為:細(xì)胞加工處理(cellularprocess),代謝過程(metabolicprocess),生物調(diào)節(jié)(biologicalregulation)和應(yīng)激反應(yīng)(responsetostimulus)等;所參與的分子功能主要為:結(jié)合(binding)和催化活性(catalyticactivity)等;在細(xì)胞組分中,絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)都?xì)w為細(xì)胞(cell),細(xì)胞部分(cellpart),細(xì)胞器(organelle),高分子復(fù)合物(macromolecularcomplex)等。(3)通過觀察psc的活性狀態(tài),確定體外自然狀態(tài)下psc耐受h2o2的最大濃度為0.6mm,1h;利用rnai技術(shù)沉默egtpx基因表達(dá),篩選出有效干擾序列為tpxsirna-3;成功克隆egtpx基因并構(gòu)建其3個突變體,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得表達(dá),mco系統(tǒng)和還原劑DTT鑒定重組EgTPx具有抗氧化的生物學(xué)特性;棘球蚴感染、重組EgTPx及其突變體蛋白均可替代性激活巨噬細(xì)胞為M2型。(4)Eg感染可抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道高反應(yīng);HE和PAS染色顯示Eg感染可減少OVA誘導(dǎo)的小鼠肺支氣管周圍的炎性細(xì)胞浸潤及粘液分泌;RT-qPCR和流式檢測顯示Eg感染后Treg細(xì)胞及IL-10水平升高,Th17細(xì)胞及IL-17A水平降低,推測Eg感染可能是通過上調(diào)了IL-10的表達(dá),下調(diào)了IL-17A的表達(dá),導(dǎo)致了Treg/Th17的失衡從而抑制哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。結(jié)論:(1)成功建立穩(wěn)定的細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴體外成囊培養(yǎng)模型,可完全剔除宿主因素的干擾,研究特定因素對蟲體生長與發(fā)育的作用,為后續(xù)囊液蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供充足的實驗材料。(2)成功建立微囊法接種小鼠細(xì)粒棘球蚴和多房棘球蚴繼發(fā)感染動物模型,有利于進(jìn)行疫苗的研制,藥物篩選和療效的判定,為預(yù)防和控制棘球蚴病起重要指導(dǎo)作用和奠定堅實基礎(chǔ)。(3)首次對體外培養(yǎng)獲得的棘球蚴囊液進(jìn)行了較為全面、系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,鑒定到一些高表達(dá)的分泌蛋白,它們與宿主之間的相互作用、自身的能量代謝、抗氧化損傷密切相關(guān),對于維持蟲體正常的生命活動具有重要意義。深入研究這些蛋白質(zhì)的功能,將為闡明某些棘球絳蟲免疫逃避的分子機制提供重要理論依據(jù)。(4)利用RNAi技術(shù)通過電轉(zhuǎn)途徑可有效沉默細(xì)粒棘球蚴EgTPx基因的表達(dá),明確EgTPx對細(xì)粒棘球蚴抵抗氧化損傷,維持正常生長存活十分必要,研究結(jié)果將為棘球絳蟲及其他寄生蟲基因功能的研究提供技術(shù)參考資料。(5)成功構(gòu)建并表達(dá)EgTPx基因及其3個突變體,明確棘球蚴感染和抗氧化蛋白EgTPx可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化,從而釋放抗炎因子,對于抑制Th1型炎癥反應(yīng)和促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答,維持在宿主體內(nèi)的寄生至關(guān)重要。(6)利用細(xì)粒棘球蚴感染并發(fā)過敏性哮喘實驗動物模型,發(fā)現(xiàn)Eg感染對過敏性哮喘氣道炎癥具有減輕或抑制作用。Eg感染引起Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10的水平升高,Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A的水平降低,通過IL-10可抑制Th17細(xì)胞的分化導(dǎo)致Treg/Th17的失衡,推測包蟲感染對宿主產(chǎn)生的這種Treg/Th17失衡的免疫調(diào)控可能是減輕或抑制過敏性哮喘氣道炎癥作用機制,為利用蠕蟲及其主要分泌蛋白的免疫調(diào)控機制開辟新的自身免疫性疾病及及過敏性疾病的防治策略提供重要依據(jù)。
[Abstract]:Objective : To study the possible mechanism of immune regulation of Echinococcus granulosus in vitro . ( 2 ) To study the possible mechanism of immune regulation of Echinococcus granulosus in vitro and to identify the possible mechanism of immune evasion in the early stage of Echinococcus granulosus infection . ( 3 ) In vitro culture of psc , the expression of egtpx gene was silenced by using rnai technique . The expression of egtpx and its mutant proteins were determined by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . (2)sds-page鏄劇ずeg鍜宔m鍥婃恫铔嬬櫧涓昏闆嗕腑鍦，

本文編號：1835986