本文選題：食管鱗癌 + HMGA2��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:侵襲和轉(zhuǎn)移是影響食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)患者預(yù)后的主要原因,積極深入探討影響食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,對提高患者生存具有重要的臨床意義。高遷移率蛋白A2(High mobility group protein A2,HMGA2)是一種非組蛋白染色質(zhì)相關(guān)蛋白,它可通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄。HMGA2已被證實(shí)在多種腫瘤中高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和不良預(yù)后密切相關(guān),然而其在食管鱗癌中的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA,可通過對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與生命過程中一系列重要過程。mi R-204-5p和miR-137已被證實(shí)在多種腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等惡性生物學(xué)行為相關(guān),但與食管鱗癌的關(guān)系尚不明確。本研究旨在明確HMGA2及miR-204-5p和miR-137在食管鱗癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,并進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)明確其對食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,明確miR-204-5p和mi R-137靶向HMGA2基因調(diào)控食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為闡明食管鱗癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和尋找新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)提供理論支持。方法:1、采用qRT-PCR和Western blot方法檢測52例新鮮食管鱗癌患者癌組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中HMGA2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。采用免疫組化SP法檢測178例食管鱗癌患者石蠟組織標(biāo)本中HMGA2蛋白的表達(dá),分析其表達(dá)水平與患者臨床病理資料之間的相關(guān)性及其對患者生存的影響。2、選出HMGA2高表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞系,首先應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制細(xì)胞系中HMGA2的表達(dá),MTT實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2對細(xì)胞增殖的影響,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2對細(xì)胞克隆形成能力的影響,劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2對細(xì)胞遷移能力的影響,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HMGA2對細(xì)胞侵襲能力的影響。隨后應(yīng)用Western blot及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察干擾細(xì)胞系中HMGA2的表達(dá)后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的變化。最后應(yīng)用免疫組化方法檢測食管鱗癌組織中HMGA2與EMT相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的相關(guān)性。3、采用qRT-PCR技術(shù)檢測52例食管鱗癌患者新鮮癌組織與癌旁組織標(biāo)本中miR-204-5p和miR-137的表達(dá)水平,分析其相對表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。在食管鱗癌細(xì)胞系中上調(diào)miR-204-5p或miR-137的表達(dá)后,首先應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移能力的變化,并進(jìn)一步采用Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)水平的變化,最后在食管鱗癌組織標(biāo)本中分析mi R-204-5p或mi R-137與HMGA2 mRNA之間表達(dá)的相關(guān)性。4、驗(yàn)證miR-204-5p或miR-137對HMGA2基因的靶向調(diào)控,利用Target Scan和miRanda等信息學(xué)軟件分析miR-204-5p或mi R-137與HMGA2基因啟動(dòng)子區(qū)域可能的結(jié)合靶點(diǎn),雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證二者對HMGA2基因的直接負(fù)性調(diào)控。在食管鱗癌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染入mi R-204-5p mimic或mi R-137 mimic及HMGA2過表達(dá)質(zhì)粒后,劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。結(jié)果:1、qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示:HMGA2 mRNA和蛋白在新鮮食管鱗癌組織中的相對表達(dá)水平明顯高于癌旁正常食管黏膜組織;免疫組化檢測結(jié)果顯示HMGA2蛋白在食管鱗癌組織中的高表達(dá)率明顯高于正常食管黏膜組織中的表達(dá)率(52.8%vs.27.5%,P=0.004)。HMGA2的表達(dá)水平與腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)(P0.05);HMGA2高表達(dá)患者5年生存率明顯低于HMGA2低表達(dá)患者(24.9%vs 42.3%,P=0.009),多因素分析顯示,HMGA2表達(dá)是影響本組食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR 1.484,95%CI 1.012~2.175,P=0.040)。2、HMGA2在食管鱗癌Kyse-30和Ec-109細(xì)胞系中高表達(dá),RNA干擾技術(shù)可有效降低食管鱗癌細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)水平。MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),下調(diào)HMGA2表達(dá)后可明顯降低食管鱗癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力;劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)表明,下調(diào)HMGA2表達(dá)后可明顯抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。3、Western blot法檢測發(fā)現(xiàn),干擾食管鱗癌Kyse-30和Ec-109細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)后,上皮性指標(biāo)E-cadherin的表達(dá)明顯升高,間質(zhì)性指標(biāo)N-cadherin,Vimentin及Snail的表達(dá)顯著降低;細(xì)胞免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn),下調(diào)HMGA2的表達(dá)后,E-cadherin胞膜表達(dá)增加,N-cadherin的胞漿表達(dá)減弱。同時(shí),細(xì)胞中β-catenin由細(xì)胞漿及細(xì)胞核向胞膜轉(zhuǎn)移,與細(xì)胞膜結(jié)合的β-catenin明顯增加。4、qRT-PCR檢測顯示,在食管鱗癌組織中mi R-204-5p和miR-137的表達(dá)水平均顯著低于癌旁組織(P0.01);miR-204-5p表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P0.05),miR-137表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度顯著相關(guān)(P0.05);上調(diào)Kyse-30和Ec-109細(xì)胞中miR-204-5p或miR-137的表達(dá)后,細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到明顯的抑制,同時(shí)可明顯降低HMGA2蛋白的表達(dá)水平;相關(guān)性分析結(jié)果顯示在食管鱗癌組織中mi R-204-5p或miR-137的相對表達(dá)水平均與HMGA2 mRNA的表達(dá)水平呈顯著性負(fù)相關(guān)性(r2=0.609及0.682,P均0.001)。5、TargetScan和miRnada生物信息學(xué)預(yù)測軟件提示HMGA2可能是miR-204-5p和miR-137的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示HMGA2是miR-204-5p和miR-137的直接作用靶基因;miR-204-5p或miR-137對食管鱗癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力的抑制作用可以部分地被HMGA2過表達(dá)質(zhì)粒所削弱。結(jié)論:1、HMGA2高表達(dá)于食管鱗癌中,并與腫瘤增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān),是患者預(yù)后不良的指標(biāo),有望成為食管鱗癌治療的分子靶點(diǎn)。2、HMGA2參與了調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲過程,是食管鱗癌細(xì)胞的惡性表型。HMGA2可通過調(diào)控β-catenin的移位,進(jìn)而調(diào)控EMT的發(fā)生而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。3、miR-204-5p和miR-137均低表達(dá)于食管鱗癌中,且與腫瘤的增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)表型具有一定關(guān)系。4、HMGA2為miR-204-5p和miR-137的直接調(diào)控靶基因,可通過下調(diào)HMGA2的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of miR - 204 - 5p and miR - 137 on invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma ( ESCC ) . Results : 1 銆，

本文編號：1818463