本文選題：腦梗死 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞�。� 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：腦梗死為臨床常見疾病,是由于神經(jīng)細(xì)胞的缺血耐受性和再生能力差,其致殘率和死亡率高,多年來其臨床治療方法法無根本性的進(jìn)展,給家庭和社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)。干細(xì)胞治療近年來發(fā)展迅速,已涉及多種不同領(lǐng)域,為多種難治性疾病,如帕金森、阿爾茲海默癥、糖尿病等帶來了新的希望。近年來隨著干細(xì)胞研究和組織工程的發(fā)展,特別是成體干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化潛能的發(fā)現(xiàn),同時(shí)其具有取材方便和符合倫理學(xué)等特點(diǎn),使其成為進(jìn)展最迅速的一個(gè)領(lǐng)域。許多動物實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用干細(xì)胞移植治療腦梗死能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和修復(fù),明顯改善實(shí)驗(yàn)動物的預(yù)后,已經(jīng)開始進(jìn)行的少量臨床試驗(yàn)也證實(shí)了其可行性和安全性。然而,隨著越來越多的研究證實(shí)移植的干細(xì)胞到達(dá)損傷腦組織的數(shù)量很少,存活的時(shí)間較短而且長期存活的比例極低,也沒有充分的證據(jù)表明干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為自體神經(jīng)細(xì)胞及建立神經(jīng)突觸聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用干細(xì)胞治療心肌、肝及腎臟疾病時(shí),單純移植干細(xì)組植干細(xì)基同樣有較樣的治療效果,并且避免了細(xì)胞移植造成的一些并發(fā)癥,從而提出了旁分泌假說。本研究第一部分,通過分離、培養(yǎng)和鑒定犬骨髓來源成體干細(xì)胞,建立穩(wěn)定的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)系,并鑒定它們的干細(xì)胞特性。通過缺氧預(yù)處理BMSCs與粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)共培養(yǎng),增強(qiáng)其增殖、遷移及神經(jīng)分化能力。本研究第二部分,通過慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs,使其過表達(dá)目的基因,并研究其在超順磁氧化鐵納米顆粒(Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)標(biāo)記后細(xì)胞功能及級神經(jīng)分化能力。在研究的第三部分,通過血栓彈力圖及體外磁共振檢測不同比例血液成分構(gòu)成血栓,明確不同血栓成分其血栓強(qiáng)度與磁共振信號變化對應(yīng)關(guān)系。在研究的第四部分,通過改良犬自體血栓構(gòu)建犬腦梗列模型,并由頸內(nèi)動脈途徑注射基因修飾干細(xì)胞并對其進(jìn)行影像學(xué)評估,研究基因修飾后BMSCs對腦梗死的修復(fù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。本研究為BMSCs在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域積累了實(shí)驗(yàn)研究資料,揭示了其對腦梗死治療的可能性。 、缺氧預(yù)處理聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子對犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用研究1分離、培養(yǎng)和鑒定犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穿刺抽取犬肱骨上段骨髓液,采用密度梯度離心法分離犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),通過貼壁法純化培養(yǎng)至P2,流式細(xì)胞分析BMSCs不表達(dá)CD34,CD45,表達(dá)CD44,CD90等間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原。BMSCs具有多向分化潛能,經(jīng)一定誘導(dǎo),可在體外向中胚層細(xì)胞系,如成骨、成脂胞分化。BMSCs在體外易于擴(kuò)展培養(yǎng)且可在不同代次冷凍保存,在液氮中冷凍12個(gè)月后復(fù)蘇,對干細(xì)胞增殖能力基本無影響,可繼續(xù)培養(yǎng)或用于進(jìn)一步研究。2缺氧預(yù)處理BMSCs與粒細(xì)胞集落測激因子共培養(yǎng)細(xì)胞功能與神經(jīng)分化能力檢測取P3 BMSCs于低氧培養(yǎng)箱,以1%氧濃度作為缺氧處理氧濃度,以6h、12h及24h作為缺氧處理時(shí)間,通過CCK-8檢測缺氧處理后細(xì)胞增殖能力,Transwell試驗(yàn)檢測缺氧處理后細(xì)胞遷移能力,結(jié)果表明缺氧預(yù)處理12h組干細(xì)胞增殖、遷移能力高于其他組別(P0.05)。其后以12h作為缺氧預(yù)處理時(shí)間,以常氧組作為對照組,對BMSCs進(jìn)行體外神經(jīng)定向誘導(dǎo)分化,結(jié)果表明缺氧組神經(jīng)分化率高于常氧組(68.5%±5.3%v.s.54.3%±7.4%,P0.05),real-time PCR 檢測相關(guān)神經(jīng) marker MAP-2、NF-L 明顯高于常氧組,細(xì)胞遷移能力HH相關(guān)細(xì)胞因子CXCR-4表達(dá)量亦明顯高于常氧組(P0.05)。粒細(xì)胞集落刺激因子可進(jìn)一步促進(jìn)缺氧預(yù)處理后BMSCs的增殖遷移能力。二、基因修飾、SPIO標(biāo)記犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后的神經(jīng)分化能力檢測1 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)目的基因細(xì)胞系采用逐孔稀釋法復(fù)核病毒滴度,以不同稀釋倍數(shù)稀釋病毒液并轉(zhuǎn)染P3BMSCs,轉(zhuǎn)染后通過Guava Express analysis軟件分析綠色熒光表達(dá)量,并通過cell counting kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞活力,以明確慢病毒對犬BSMCs的親嗜性,并確定最佳復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI值),本研究明確了MOI=10時(shí),BMSCs具有佳綠色熒光蛋白表達(dá)率及細(xì)胞活力值。通過real-time PCR檢測目的基因BDNF(brain-derived neurotrophic factor)表達(dá)含量明顯增高。慢病毒對BMSCs具有較優(yōu)秀的親嗜性,可構(gòu)建穩(wěn)定的高表達(dá)BDNF細(xì)胞系。2 BDNF-BMSCs體外SPIO標(biāo)記及神經(jīng)誘導(dǎo)分化分別以不同濃度SPIO體外標(biāo)記犬BMSCs,通過結(jié)合標(biāo)記效率指標(biāo)普魯士藍(lán)染色及臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞毒性,明確SPIO濃度于20μg/mL時(shí),BMSCs具有良好的標(biāo)記率及低細(xì)胞毒性。在一定條件下對BDNF-SPIO-BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化,可見BMSCs細(xì)胞形態(tài)上首先出現(xiàn)神經(jīng)樣改變,兔疫熒光及real-time PRC可檢測神經(jīng)Marker Nestin,GFAP,TUJ1等表達(dá)量明顯高于對照組,同時(shí)目的基因亦有明顯高表達(dá)。三、不同成分血栓的血栓彈力圖檢測及體外磁共振成像研究1不同成分犬血樣進(jìn)行血栓彈力圖檢測以穿刺針分別穿刺犬股動靜脈,通過5F鞘抽取動靜脈全血,以4000r/min離心10min,分層后吸取上清層及中間薄膜層。以動脈全血、靜脈全血、動脈上清+薄膜層(動脈上清組)及靜脈血清 +薄膜層(靜脈上清組)分組,分別檢測其血栓彈力圖(TEG),血常規(guī)及病理學(xué)HE染色。結(jié)果證實(shí):犬全血相比人類相對高凝,上清組血栓形成速率低于全血組,全血組MA值均明顯高于上清組(P0.001),而靜脈上清組MA值高于動脈上清組(P=0.041),表明全血制作血栓其血栓強(qiáng)度可能優(yōu)于上清組,而靜脈上清組制作的血栓其血栓強(qiáng)度可能優(yōu)于動脈上清組。2不同成分犬血制作血栓進(jìn)行體外影像學(xué)及病理學(xué)檢測以上述組別血液成分靜置于1.8ml凍存管2h制作血栓分組,以碘油及水作為對照組,置于含明膠溶劑為媒介的塑料器皿中,通過螺旋3T磁共振體外掃描。結(jié)果證實(shí)上清組血栓信號穩(wěn)定,且T2WI信號值明顯高于全血組,上清組間靜脈組略高于動脈組(364±17,358±20),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。病理學(xué)檢測證實(shí),全血組以紅細(xì)胞為著,布滿視野,而上清組紅細(xì)胞顯著減少,并可見纖維蛋白,與血常規(guī)檢測相符。綜合分析,靜脈上清制作血栓信號穩(wěn)定,血栓強(qiáng)度優(yōu)于動脈組,血栓成分中,隨紅細(xì)胞比例增加,T2WI信號值減低。四、動脈內(nèi)移植基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療犬腦梗死的研究1.犬大腦中動脈栓塞聯(lián)合頸內(nèi)動脈近端血流阻斷建立腦梗死模型及其影像學(xué)評估采用改良Seldinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動脈置入5F導(dǎo)管鞘。經(jīng)股動脈鞘引入5F椎動脈導(dǎo)管,超選至頸內(nèi)動脈上升段約2cm。分別將1.4mm、1.7mm直徑血栓放入裝有對比劑(歐乃派克300)的2ml注射器中將血栓注入導(dǎo)管,并給以間斷性壓力緩慢注射,分別栓塞大腦中動脈遠(yuǎn)端及M1段的近端,完成相對大面積腦梗死建模。腦梗建模后6小時(shí)進(jìn)行T2WI,可初次在栓塞大腦中動脈供血區(qū)域見到異常高信號,隨時(shí)間進(jìn)展,腦梗病灶范圍變小,界限變清晰(圖5)。建模24小時(shí)后,校正后平均腦梗死體積為4173.23± 603.92mm3。模型建立后7天平局腦梗死為3273.21 ± 616.05 mm3,其體積較建模24小時(shí)校正后腦梗體積明顯減小(P0.01)。2 SPIO-BMSCs經(jīng)動脈途徑移植影像學(xué)示蹤研究以20μg/mLSPIO進(jìn)行犬BMSCs、BDNF-BMSCs標(biāo)記后,經(jīng)犬頸內(nèi)動脈注射1×106數(shù)量級干細(xì)胞,通過磁共振對比分析兩組干細(xì)胞在移植前、移植后不同時(shí)間點(diǎn)(1小時(shí)、24小時(shí)、1周、2周、3周、4周)在梗死灶示蹤狀況。結(jié)果示標(biāo)記細(xì)胞在3.0TMRIT2*WI和SWI序列上信號減低最明顯。隨標(biāo)記后培養(yǎng)時(shí)間延長,SPIO標(biāo)記率及信號強(qiáng)度均下降,體外MRI僅可示蹤到4周左右,兩組間無明顯差異。3經(jīng)動脈途徑移植基因修飾干細(xì)胞治療犬腦梗死建模1周后將18只比格犬隨機(jī)分為3組:BDNF+組(A組),BDNF-組(B組)及空白對照組(C組),各組腦梗體積分別為:3166.10±487.77、3292.05±518.62、3204.80±359.37,組間腦梗體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。隨時(shí)間推移不同組別腦梗體積呈現(xiàn)不同程度下降,移植組(A、B組)于移植后第二周腦梗體積明顯低于未移植組,表明細(xì)胞移植組療效優(yōu)于未移植組(C組),第四周A組梗死體積明顯低于B組,表明BDNF+BMSCs療效優(yōu)于BDNF-組,即單純BMSCs組。建模1周后各組犬神經(jīng)系統(tǒng)評分分別為:4.50±0.75、4.37±1.18、4.87±0.64,組間腦梗體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。隨時(shí)間推移不同組別犬神經(jīng)系統(tǒng)評分呈現(xiàn)不同程度下降,細(xì)胞移植后第一周起,移植組(A、B組)犬神經(jīng)功能評分顯著低于未移植組(C組),P=0.004;多重比較顯示A、B組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P0.05。細(xì)胞移植后第二周起,A組犬神經(jīng)功能評分明顯低于B組(2.37±0.51,2.87±0.35,P=0.037);至移植后第四周,犬神經(jīng)功能評分分別為1.62±0.51、2.12±0.35、2.75±0.46(P0.001)。結(jié)論本研究成功分離、培養(yǎng)了犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),明確了缺氧處理可增強(qiáng)BMSCs的體外增殖、遷移能力以及神經(jīng)分化潛能,說明了 BMSCs比較適于適應(yīng)缺氧環(huán)境,同時(shí)其神經(jīng)分化潛能的增強(qiáng)更有力的證明了其在體內(nèi)缺氧環(huán)境(腦梗死灶)發(fā)揮替代作用的可能性。經(jīng)過慢病毒轉(zhuǎn)染與SPIO標(biāo)記,BMSCs成功過表達(dá)目的基因BDNF,其神經(jīng)分化能力進(jìn)一步提高。以犬改良自體血栓構(gòu)建腦梗死為基礎(chǔ),證實(shí)BDNF-BMSCs的移植可進(jìn)一步減低梗死面積,改善腦梗預(yù)后。
[Abstract]:In the third part of the study , we found that the transplantation of stem cells to treat cerebral infarction can promote the regeneration and repair of neural cells , improve the prognosis of experimental animals . ,緙烘哀棰勫鐞嗚仈鍚堢矑緇嗚優(yōu)闆嗚惤鍒烘縺鍥犲瓙瀵圭姮楠ㄩ珦闂村厖璐ㄥ共緇嗚優(yōu)鐨勪綔鐢ㄧ爺絀，

本文編號：1792954