本文選題：肺纖維化 + 槲皮素�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及目的:肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種重癥肺部疾病,是各種不同病因引起的間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease,ILD)病情進展的最終結(jié)局。很多原因不明的ILD患者最后確診與結(jié)締組織病(connective tissue disease,CTD)相關(guān),稱為結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease,CTD-ILD),其中以系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病率最高,可高達60%至70%。而且結(jié)締組織病患者一旦出現(xiàn)了 PF,預(yù)后極差,可在短期內(nèi)因重癥感染和/或呼吸衰竭死亡。目前糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑仍是主要方法,但是該方案副作用明顯,不良反應(yīng)多,且對中后期患者治效果差。因此研究其發(fā)病機制及治療方法尤為重要�，F(xiàn)在PF的確切的發(fā)病機制尚不清楚,近些年來,氧化應(yīng)激(oxidative stress)在PF發(fā)病中的作用得到越來越多的重視。氧化應(yīng)激是一種引起分子、細胞和組織損傷的免疫應(yīng)答,其誘發(fā)是因為活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成過多和/或抗氧化防御功能下降。研究發(fā)現(xiàn)吸入氣中氧分壓為150mmHg,肺泡中氧分壓為100mmHg,而靜脈血的氧分壓在1至45mmHg之間,這就表明肺一直暴露在高濃度的氧中,因此,相對于其他器官,肺更容易受到氧化應(yīng)激的損傷。而且聯(lián)合抗氧化應(yīng)激治療如應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸在PF治療中取得一定的成果。槲皮素(quercetin,QUE)在自然界中非常之多,其中在茶葉、槐花、洋蔥、西蘭花及柴胡等中含量較高,具有很多生物學(xué)活性。近年來,越來越多的專家學(xué)者對槲皮素進行了研究,發(fā)現(xiàn)其可以直接清除ROS,表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激作用。而且國外曾試用槲皮素治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病,取得了良好的效果。因此我們推測其有助于改善肺纖維化的進展。本研究旨在通過構(gòu)建博來霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的SD大鼠肺纖維化模型,研究槲皮素對肺纖維化治療及其對氧化應(yīng)激的作用,同時還研究其對氧化應(yīng)激相關(guān)的MMP-1、TIMP-1、miR-21和TGF-β1/Smad信號通路的影響,以期發(fā)現(xiàn)其新的功能,指導(dǎo)其在臨床中的應(yīng)用。方法:將60只體重300g-350g的SD大鼠隨機平均分為3組:正常對照組、博來霉素組(BLMgroup)和博來霉素+槲皮素組(BLM+QUEgroup),每組20只。BLM組通過向氣管內(nèi)一次性注入BLM5mg/kg構(gòu)建大鼠肺纖維化模型;正常對照組采取向氣管內(nèi)一次性注入同體積生理鹽水;BLM+QUE組采用向氣管內(nèi)一次性注入BLM5mg/kg的當日給予腹腔內(nèi)注射槲皮素3mg/kg,每日一次,直至大鼠被處死。每組大鼠分別在建模后第12、24及36天隨機處死6只。第一部分:槲皮素對博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的治療作用1.觀察大鼠的一般情況及肺組織的外觀,并稱重,計算肺系數(shù)(lung coefficient);同時觀察大鼠肺組織的HE染色及Masson染色情況,并進行纖維化評分。2.顯微鏡下觀察大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的細胞,計算得出細胞總數(shù),并于染色后進行分類計數(shù)。3.檢測大鼠BALF中的總蛋白含量及肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。第二部分:槲皮素對肺纖維化大鼠氧化應(yīng)激的影響檢測大鼠肺組織氧化應(yīng)激標志物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量;檢測肺組織還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSH)的含量,并計算得出還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值;同時測定肺組織總抗氧化能力(total anti-oxidative capacity,T-AOC)。第三部分:槲皮素對氧化應(yīng)激相關(guān)細胞因子MMP-1及其抑制劑TIMP-1的影響1.提取肺組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和組織型金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的 mRNA 的表達情況并進行分析。2.應(yīng)用免疫組化法檢測肺組織中MMP-1和TIMP-1蛋白的表達情況并進行分析。第四部分:槲皮素對肺纖維化大鼠miR-21及TGF-β1/Smad信號通路的影響1.將總RNA應(yīng)用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用RT-PCR方法檢測miR-21的表達情況。2.應(yīng)用 RT-PCR 方法檢測轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Smad7的mRNA的表達情況并進行分析。3.應(yīng)用Western blot法檢測肺組織中TGF-β1和Smad7蛋白的表達情況并進行分析。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組之間比較應(yīng)用t檢驗,多組之間比較采用單因素方差分析,以P0.05被視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:第一部分:1.大鼠一般情況:正常對照組不同時間點皮毛光亮,活動好,飲水進食量可,呼吸順暢,體重穩(wěn)步上升;BLM組大鼠皮毛無光澤,活動減少,飲水進食減少,呼吸急促,咳喘明顯,在第12天即表現(xiàn)出體重明顯下降,后期體重雖有所增加,但仍顯著少于正常對照組大鼠(12天、24天、36天:P0.01),第7天死亡1只;BLM+QUE組大鼠皮毛光澤度一般,活動有所減少,早期飲水進食略減少,有咳喘,后有所緩解,其體重明顯高于同時間BLM組(12天、24天、36天:P0.01)。2.肺組織情況:正常對照組不同時間點外表紅潤光滑,質(zhì)地均勻,富有彈性;BLM組早期腫脹明顯,點灶狀出血較明顯,晚期實變明顯,體積明顯縮小;BLM+QUE組顏色略偏深,表面少許點狀出血,彈性一般。不同時間點BLM組大鼠肺系數(shù)較正常對照組明顯增高(12天、24天、36天:P0.05);不同時間點BLM+QUE組大鼠肺系數(shù)小于BLM組,二者在第36天時有明顯差異(P0.05)。3.病理學(xué)情況:HE染色及Masson染色結(jié)果表明,正常對照組不同時間點未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥細胞的浸潤和膠原纖維的沉積;BLM組大鼠早期即發(fā)現(xiàn)明顯炎癥細胞浸潤,少量膠原纖維沉積;后期可見炎癥細胞明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯,肺間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維沉積;BLM+QUE組大鼠的早期炎癥較輕,炎癥細胞較少;后期纖維化程度較輕。不同時間點BLM組大鼠纖維化分數(shù)較正常對照組明顯升高(12天、24天、36天:P0.01);而不同時間點BLM+QUE組大鼠纖維化分數(shù)明顯小于 BLM 組(12 天:P0.05,24 天、36 天:P0.01)。4.BALF細胞計數(shù)及分類計數(shù):正常對照組不同時間點細胞計數(shù)及分類計數(shù)無明顯變化;不同時間點BLM組細胞計數(shù)明顯高于正常對照組(12天、24天、36天:P0.01);不同時間點BLM+QUE組細胞計數(shù)明顯低于BLM組(12天、24天、36天:P0.05)。分類計數(shù)發(fā)現(xiàn)正常對照組不同時間點中性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞比例無顯著變化;BLM組大鼠與正常對照組相比中性粒細胞比列有增高趨勢,在36天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),淋巴細胞比例有增高趨勢,12天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(12天、24天、36:P0.05),巨噬細胞比例有下降趨勢,12天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(12天、24天、36天:P0.05);BLM+QUE組大鼠與BLM組相比,中性粒細胞比例有所下降,在36天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)、淋巴細胞比例有所下降,24天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24天、36天:P0.05),巨噬細胞比例有所升高,36天后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.BALF總蛋白及大鼠肺組織HYP含量測定:正常對照組不同時間點BALF總蛋白含量無明顯變化;BLM組BALF總蛋白第12天明顯升高,此后逐步下降,但仍明顯高于正常對照組(12天、24天:P0.01;36天:P0.05);BLM+QUE組BALF總蛋白含量24天后明顯低于BLM組(24天、36天P0.01)。正常對照組不同時間點肺組織HYP含量無明顯變化;BLM組肺組織HYP含量較正常對照組明顯增加(12天:P0.05,24天、36天:P0.01);BLM+QUE組肺組織HYP含量24天后較BLM組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24天、36天:P0.01)。第二部分:1.大鼠肺組織MDA含量測定:正常對照組不同時間點肺組織MDA含量無明顯變化;第12天時三組大鼠肺組織MDA含量差異無顯著差異;BLM組大鼠24天后MDA含量明顯高于正常對照組(24天、36天:P0.01);36天后BLM+QUE組大鼠MDA含量明顯低于BLM組(P0.01)。2.大鼠肺組織GSH/GSSH比值:正常對照組不同時間點肺組織GSH/GSSH無明顯變化;BLM組24天后肺組織GSH/GSSH較正常對照組明顯降低(24天、36天:P0.01);BLM+QUE組24天后肺組織GSH/GSSH明顯高于BLM組(24天、36 天:P0.01)。3.大鼠肺組織T-AOC測定:正常對照組不同時間點肺組織T-AOC無明顯變化;BLM組肺組織24天后T-AOC顯著低于正常對照組(24天:P0.05,36天:P0.01);BLM+QUE組24天后肺組織T-AOC較BLM組大鼠明顯增加(24天、36 天:P0.05)。第三部分:1.RT-PCR檢測MMP-1和TIMP-1的mRNA表達:正常對照組不同時間點MMP-1和TIMP-1的mRNA表達無明顯變化;與正常對照組相比,BLM組MMP-1 和 TIMP-1 的 mRNA 均顯著增加(12 天、24 天、36天 MMP-1:P0.01;12 天 TIMP-]:P0.05,24 天、36 天 TIMP-1:P0.01);與 BLM 組相比,BLM+QUE組MMP-1和TIMP-1的mRNA水平明顯下降,均在24天后表現(xiàn)為顯著性差異(24 天、36 天 MMP-1:P0.05;24 天 TIMP-1:P0.05,36 天 TIMP-1:P0.01)。2.免疫組化測定MMP-1和TIMP-1蛋內(nèi)表達:正常對照組不同時間點MMP-1及TIMP-1蛋白表達變化不明顯;與正常對照組相比,BLM組MMP-1及TIMP-1蛋白表達明顯增加(12天、24天、36天MMP-1:P0.01;12天、24天TIMP-1:P0.05,36 天 TIMP-1:P0.01);不同時間點 BLM+QUE 組大鼠 MMP-1 及 TIMP-1蛋白表達均低于BLM組,MMP-1在24天后表現(xiàn)為顯著性差異(24天:P0.01,36天:P0.05),TIMP-1在36天后表現(xiàn)為統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。第四部分:1.RT-PCR檢測miR-21表達:正常對照組不同時間點miR-21表達無明顯變化;與正常對照組相比,BLM組miR-21水平顯著增加(12天:P0.05、24天、36天:P0.01);與BLM組相比,BLM+QUE組miR-21水平比明顯下降,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)意義(24天:P0.05,36天:P0.01)。2.RT-PCR檢測TGF-β1和Smad7的mRNA表達:正常對照組不同時間點TGF-β1和Smad7的mRNA表達無明顯變化;與正常對照組相比,BLM組TGF-β1 mRNA 顯著增加(12 天、24 天、36 天:P0.01),Smad7mRNA 顯著減少(12天:P0.05,24 天、36 天:P0.01);與 BLM 組相比,BLM+QUE 組 TGF-β1 mRNA水平比明顯下降(12天、24天、36天:P0.01),Smad7mRNA水平明顯升高,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(24天、36天:P0.05)。3.Western blot法檢測TGF-β1和Smad7蛋白的表達:正常對照組不同時間點TGF-β1和Smad7蛋白表達變化不明顯;與正常對照組相比,BLM組TGF-β1顯著增加(12天、24天、36天:P0.01),Smad7顯著減少,24天后有統(tǒng)計學(xué)意義(24天、36天:P0.05);與BLM組相比,BLM+QUE組TGF-β1水平比明顯下降(12天、24天、36天:P0.01),Smad7水平明顯升高,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(24天、36天:P0.05)。結(jié)論:1.通過經(jīng)氣管注入博來霉素的方法可以成功構(gòu)建大鼠肺纖維化模型,用于肺纖維化的實驗研究。2.槲皮素能夠改善肺纖維化大鼠的總體狀況,減輕其炎性損傷和減少膠原蛋白沉積。3.槲皮素不但可以抑制肺組織ROS生成,而且還增強肺組織的抗氧化能力,表明其能夠抑制氧化應(yīng)激減輕肺纖維化。4.槲皮素能夠抑制MMP-1、TIMP-1的表達,部分恢復(fù)MMPs/TIMPs失衡狀態(tài),減少膠原沉積,促進細胞外基質(zhì)降解,改善肺纖維化。5.槲皮素能夠抑制TGF-β1、miR-21的表達,增強Smad7的活性,通過干預(yù)TGF-β1/Smad信號通路減輕肺纖維化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.2;R563

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本文編號：1787344