本文選題：原發(fā)性肝細(xì)胞癌 + 肝炎病毒�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分肝炎病毒感染調(diào)控肝癌增殖和轉(zhuǎn)移作用和機(jī)制的研究:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前我國及世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一,發(fā)生率在所有惡性腫瘤中居第五位,導(dǎo)致的死亡率在所有惡性腫瘤中排第三位。由于該病起病隱匿,早期沒有癥狀或癥狀不十分明顯,病程進(jìn)展迅速,因此確診時大多數(shù)患者已經(jīng)達(dá)到中晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,治療困難,導(dǎo)致預(yù)后差、病死率極高。目前肝癌的病因及確切分子機(jī)制尚不明確,普遍認(rèn)為是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是肝癌發(fā)生的最主要致病原因,約占到全部肝癌的70 85%。以往的研究表明感染有肝炎病毒的原發(fā)性肝癌患者的無瘤生存時間和整體生存時間均明顯差于無病毒感染的原發(fā)性癌患者。通過我們科室前期的研究發(fā)現(xiàn)行肝部分切除術(shù)后存在普遍的病毒再激活現(xiàn)象,肝炎病毒再活化在肝癌的發(fā)展中起到了重要作用,并且能影響肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)期生存率。以往的研究表明肝癌術(shù)后持續(xù)的抗病毒治療有望降低病毒載量,減輕肝臟炎癥從而緩解肝臟負(fù)荷,降低晚期復(fù)發(fā)生存率和提高整體生存率從而達(dá)到改善肝癌術(shù)后預(yù)后的目的。我們前期的一項研究結(jié)果表明,抗病毒治療沒有起到直接發(fā)揮抗腫瘤作用,而是可以通過抑制肝炎病毒活性減輕肝臟慢性炎癥,從而降低第二次原發(fā)肝癌發(fā)生的概率,而不能起到降低肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的作用。目前對于抗病毒治療是否能夠達(dá)到抗腫瘤的目的仍然存在爭議,因此有必要明確病毒復(fù)制在肝癌復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制,尋找病毒感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展的特異性信號通路。本研究擬通過高通量測序手段識別肝炎病毒感染引起肝癌發(fā)生聯(lián)系密切的基因和信號通路,進(jìn)而明確肝炎病毒感染引起相關(guān)基因和信號通路發(fā)生變化的具體機(jī)制。接下來,我們將重點研究這些基因和信號通路通過怎樣的調(diào)控方式來促進(jìn)肝癌腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究不僅能夠闡明病毒性肝炎感染導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展的特異性機(jī)制,更能為未來的抗病毒治療提供更多的個性化治療方案。在本研究中首先通過高通量測序的手段檢測正常肝臟組織、無病毒感染的原發(fā)肝癌組織、乙型肝炎病毒感染的原發(fā)肝癌組織、丙型肝炎病毒感染的原發(fā)肝癌組織中各組間轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平,結(jié)合信息學(xué)分析篩選在病毒感染的原發(fā)肝癌組織中特異性差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本,進(jìn)一步系統(tǒng)、深入地揭示重要基因在病毒感染的肝癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色,為肝癌的診斷和治療以及合理的抗病毒治療提供新的分子靶標(biāo)和理論依據(jù)。在我們的課題研究中獲得了如下結(jié)果:通過高通量測序和生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)P54nrb在乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染的肝癌組織中異常高表達(dá),暗示P54nrb在肝炎病毒感染調(diào)控肝癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。通過免疫組化技術(shù)檢測P54nrb蛋白在臨床組織樣本表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),P54nrb蛋白在腫瘤組織中的高表達(dá)量與有多個惡性的臨床病理特征密切相關(guān),P54nrb蛋白高表達(dá)的病人術(shù)后的無瘤生存時間和總體生存時間均較差,多因素分析顯示P54nrb蛋白的高表達(dá)是影響肝癌病人肝癌切除術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素。體外細(xì)胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)P54nrb可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。利用裸鼠皮下成瘤模型、肝臟原位荷瘤模型、尾靜脈注射肺定植模型,發(fā)現(xiàn)P54nrb既可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力,又可促進(jìn)肝癌細(xì)胞在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶的定植能力,也驗證了P54nrb在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。機(jī)制方面,通過生物信息學(xué)分析并結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Fox D3在P54nrb的啟動子區(qū)域有潛在的結(jié)合位點,接下來我們利用染色質(zhì)免疫共沉淀、定量PCR、蛋白免疫印跡、雙熒光素酶報告基因檢測等技術(shù)證明Fox D3可直接靶向結(jié)合到的P54nrb的啟動子區(qū)域進(jìn)而抑制P54nrb的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步臨床組織樣本分析發(fā)現(xiàn)Fox D3的表達(dá)量與P54nrb恰好相反,在病毒感染腫瘤組織中異常低表達(dá)。由此我們推測病毒感染導(dǎo)致腫瘤中Fox D3的表達(dá)量下降從而導(dǎo)致了P54nrb的異常高表達(dá)。近年來有文獻(xiàn)報道證明Fox D3在腫瘤組織中異常低表達(dá)的原因與其啟動子區(qū)域受到甲基化調(diào)控密切相關(guān)。通過甲基化特異性熒光定量法檢測發(fā)現(xiàn)Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度在病毒感染的腫瘤組織中特異性的升高,揭示了Fox D3在病毒感染的腫瘤組織中特異性降低與甲基化密切相關(guān)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1是DNA進(jìn)行復(fù)制修復(fù)并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶,DNMT1過表達(dá)在腫瘤的發(fā)生中扮演著重要的角色,但是DNMT1是否在病毒感染的腫瘤組織中調(diào)控Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度從而介導(dǎo)Fox D3的表達(dá)尚不清楚。通過RT-PCR、蛋白免疫印跡、以及甲基化特異性熒光定量法檢測,我們發(fā)現(xiàn)DNMT1的表達(dá)量與病毒感染密切相關(guān),并且DNMT1確實可以調(diào)控Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度。Hbx蛋白和HCV core蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用,可以調(diào)控多個重要基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在我們的研究中鑒定出Hbx蛋白和HCV core蛋白可以促進(jìn)DNMT1的轉(zhuǎn)錄從而上調(diào)DNMT1的表達(dá)。由此我們得出肝炎病毒分泌的Hbx蛋白/HCV core蛋白通過上調(diào)DNMT1的表達(dá)從而增強(qiáng)了Fox D3的甲基化程度進(jìn)而抑制了Fox D3的表達(dá)從而導(dǎo)致了P54nrb上調(diào)最終達(dá)到促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的級聯(lián)效應(yīng)。接下來我們探索了P54nrb促進(jìn)肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子學(xué)機(jī)制,利用表達(dá)譜芯片、Ch IP-seq、生物信息學(xué)分析、和經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)等,驗證得出P54nrb可以結(jié)合到N-Ras基因的啟動子的活化區(qū)域并且促進(jìn)N-Ras基因的轉(zhuǎn)錄,從而活化RAF/ERK/MEK信號通路來發(fā)揮促進(jìn)肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用。最后我們通過對2組臨床病人的組織檢測接受抗病毒治療前后DNMT1/Fox D3/P54nrb/N-Ras表達(dá)量的檢測得出抗病毒治療能夠翻轉(zhuǎn)該信號通路的表達(dá)量,由此我們推測抗病毒治療可能通過抑制該信號通路的活化來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展從而達(dá)到一定抗腫瘤的作用。綜上所述,我們研究了病毒感染對促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展,特別是對有特殊基因參與的表觀遺傳調(diào)控的作用的分子機(jī)制進(jìn)行了深入而廣泛的探討,為進(jìn)一步理解該過程中紛繁復(fù)雜的信號通路提供了新的思路和視角,為肝癌的抗病毒治療提供了新的思路。第二部分TMED3通過IL-11/STAT3信號通路促進(jìn)原發(fā)性肝細(xì)胞癌進(jìn)展的機(jī)制研究:肝癌是全世界最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中位居第五位,而死亡率則占腫瘤相關(guān)死亡更是高居第三位。隨著外科切除、肝移植以及部分輔助療法的成熟,肝癌五年生存率有了一定程度的提高。但是,肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā),肝內(nèi)、外轉(zhuǎn)移的風(fēng)險仍較大。由于肝癌起病隱匿,早期沒有癥狀或癥狀不十分明顯、病程進(jìn)展迅速,因此確診時大部分病人診斷時既為中晚期,同時更因為血管癌栓、子灶、包膜不全和多中心發(fā)生等情況的存在,缺乏有效的治療,術(shù)后仍有很高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率,造成了肝癌預(yù)后依然很差。因此,需要全面了解肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制,探索新的更加有效的治療方法,尋找對預(yù)后和治療有指導(dǎo)意義的分子標(biāo)志物。有文獻(xiàn)報道TMED3在結(jié)腸癌中能夠抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,然而TMED3在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)情況和生物學(xué)功能國內(nèi)外尚未見有系統(tǒng)報道。因此我們的研究旨在為深入了解TMED3在肝癌惡性進(jìn)展過程中的生物學(xué)作用和分子學(xué)機(jī)制,為臨床肝癌治療提供新的、潛在治療靶點。通過Real-Time PCR和免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)TMED3在腫瘤組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織,并且我們發(fā)現(xiàn)TMED3的高表達(dá)與有侵襲性的臨床病理特征密切相關(guān),TMED3高表達(dá)的病人術(shù)后的無瘤生存時間(RFS,P=0.0128)和總體生存時間(OS,P=0.0155)都明顯低于TMED3低表達(dá)的病人,多因素分析顯示TMED3高表達(dá)是影響肝癌病人術(shù)后預(yù)后的獨立危險因素。體外細(xì)胞學(xué)實驗證實,TMED3能夠顯著的促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力,但是對于細(xì)胞的增殖能力沒有任何影響。裸鼠體內(nèi)實驗證實TMED3對肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤沒有影響,可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺部成瘤能力。接下來我們利用表達(dá)譜芯片和一系列的分子學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)TMED3上調(diào)IL-11的表達(dá)、誘導(dǎo)IL-11的自分泌、活化IL-11/STAT3信號通路。總之,我們通過對大規(guī)模肝癌臨床樣本分析,發(fā)現(xiàn)TMED3的表達(dá)與病人預(yù)后顯著相關(guān);機(jī)制方面,我們發(fā)現(xiàn)TMED3通過影響IL-11/STAT3信號通路調(diào)控肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移;我們的研究發(fā)現(xiàn)了一個潛在的肝癌治療靶點,為肝癌治療提供了新的思路。
[Abstract]:絎竴閮ㄥ垎鑲濈値鐥呮瘨鎰熸煋璋冩帶鑲濈檶澧炴畺鍜岃漿縐諱綔鐢ㄥ拰鏈哄埗鐨勭爺絀，

本文編號：1774033