發(fā)布時間：2018-04-19 17:27

  本文選題：原發(fā)性肝細胞癌 + 肝炎病毒��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：第一部分肝炎病毒感染調控肝癌增殖和轉移作用和機制的研究:肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前我國及世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一,發(fā)生率在所有惡性腫瘤中居第五位,導致的死亡率在所有惡性腫瘤中排第三位。由于該病起病隱匿,早期沒有癥狀或癥狀不十分明顯,病程進展迅速,因此確診時大多數(shù)患者已經達到中晚期或發(fā)生遠處轉移,治療困難,導致預后差、病死率極高。目前肝癌的病因及確切分子機制尚不明確,普遍認為是一個多因素、多步驟的復雜過程,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是肝癌發(fā)生的最主要致病原因,約占到全部肝癌的70 85%。以往的研究表明感染有肝炎病毒的原發(fā)性肝癌患者的無瘤生存時間和整體生存時間均明顯差于無病毒感染的原發(fā)性癌患者。通過我們科室前期的研究發(fā)現(xiàn)行肝部分切除術后存在普遍的病毒再激活現(xiàn)象,肝炎病毒再活化在肝癌的發(fā)展中起到了重要作用,并且能影響肝癌患者術后的復發(fā)和遠期生存率。以往的研究表明肝癌術后持續(xù)的抗病毒治療有望降低病毒載量,減輕肝臟炎癥從而緩解肝臟負荷,降低晚期復發(fā)生存率和提高整體生存率從而達到改善肝癌術后預后的目的。我們前期的一項研究結果表明,抗病毒治療沒有起到直接發(fā)揮抗腫瘤作用,而是可以通過抑制肝炎病毒活性減輕肝臟慢性炎癥,從而降低第二次原發(fā)肝癌發(fā)生的概率,而不能起到降低肝癌術后早期復發(fā)的作用。目前對于抗病毒治療是否能夠達到抗腫瘤的目的仍然存在爭議,因此有必要明確病毒復制在肝癌復發(fā)中的作用機制,尋找病毒感染導致肝癌發(fā)生發(fā)展的特異性信號通路。本研究擬通過高通量測序手段識別肝炎病毒感染引起肝癌發(fā)生聯(lián)系密切的基因和信號通路,進而明確肝炎病毒感染引起相關基因和信號通路發(fā)生變化的具體機制。接下來,我們將重點研究這些基因和信號通路通過怎樣的調控方式來促進肝癌腫瘤細胞的增殖和轉移。該研究不僅能夠闡明病毒性肝炎感染導致肝癌發(fā)生發(fā)展的特異性機制,更能為未來的抗病毒治療提供更多的個性化治療方案。在本研究中首先通過高通量測序的手段檢測正常肝臟組織、無病毒感染的原發(fā)肝癌組織、乙型肝炎病毒感染的原發(fā)肝癌組織、丙型肝炎病毒感染的原發(fā)肝癌組織中各組間轉錄本的表達水平,結合信息學分析篩選在病毒感染的原發(fā)肝癌組織中特異性差異表達的轉錄本,進一步系統(tǒng)、深入地揭示重要基因在病毒感染的肝癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色,為肝癌的診斷和治療以及合理的抗病毒治療提供新的分子靶標和理論依據(jù)。在我們的課題研究中獲得了如下結果:通過高通量測序和生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)P54nrb在乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染的肝癌組織中異常高表達,暗示P54nrb在肝炎病毒感染調控肝癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。通過免疫組化技術檢測P54nrb蛋白在臨床組織樣本表達情況發(fā)現(xiàn),P54nrb蛋白在腫瘤組織中的高表達量與有多個惡性的臨床病理特征密切相關,P54nrb蛋白高表達的病人術后的無瘤生存時間和總體生存時間均較差,多因素分析顯示P54nrb蛋白的高表達是影響肝癌病人肝癌切除術后預后的獨立危險因素。體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn)P54nrb可以促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。利用裸鼠皮下成瘤模型、肝臟原位荷瘤模型、尾靜脈注射肺定植模型,發(fā)現(xiàn)P54nrb既可促進肝癌細胞的體內增殖能力,又可促進肝癌細胞在遠端轉移灶的定植能力,也驗證了P54nrb在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。機制方面,通過生物信息學分析并結合已發(fā)表文獻,發(fā)現(xiàn)轉錄因子Fox D3在P54nrb的啟動子區(qū)域有潛在的結合位點,接下來我們利用染色質免疫共沉淀、定量PCR、蛋白免疫印跡、雙熒光素酶報告基因檢測等技術證明Fox D3可直接靶向結合到的P54nrb的啟動子區(qū)域進而抑制P54nrb的轉錄。進一步臨床組織樣本分析發(fā)現(xiàn)Fox D3的表達量與P54nrb恰好相反,在病毒感染腫瘤組織中異常低表達。由此我們推測病毒感染導致腫瘤中Fox D3的表達量下降從而導致了P54nrb的異常高表達。近年來有文獻報道證明Fox D3在腫瘤組織中異常低表達的原因與其啟動子區(qū)域受到甲基化調控密切相關。通過甲基化特異性熒光定量法檢測發(fā)現(xiàn)Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度在病毒感染的腫瘤組織中特異性的升高,揭示了Fox D3在病毒感染的腫瘤組織中特異性降低與甲基化密切相關。DNA甲基轉移酶1是DNA進行復制修復并維持其正常甲基化的關鍵酶,DNMT1過表達在腫瘤的發(fā)生中扮演著重要的角色,但是DNMT1是否在病毒感染的腫瘤組織中調控Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度從而介導Fox D3的表達尚不清楚。通過RT-PCR、蛋白免疫印跡、以及甲基化特異性熒光定量法檢測,我們發(fā)現(xiàn)DNMT1的表達量與病毒感染密切相關,并且DNMT1確實可以調控Fox D3啟動子區(qū)域的甲基化程度。Hbx蛋白和HCV core蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的生物學作用,可以調控多個重要基因的轉錄表達。在我們的研究中鑒定出Hbx蛋白和HCV core蛋白可以促進DNMT1的轉錄從而上調DNMT1的表達。由此我們得出肝炎病毒分泌的Hbx蛋白/HCV core蛋白通過上調DNMT1的表達從而增強了Fox D3的甲基化程度進而抑制了Fox D3的表達從而導致了P54nrb上調最終達到促進肝癌發(fā)生發(fā)展的級聯(lián)效應。接下來我們探索了P54nrb促進肝癌增殖和轉移的分子學機制,利用表達譜芯片、Ch IP-seq、生物信息學分析、和經典分子生物學技術等,驗證得出P54nrb可以結合到N-Ras基因的啟動子的活化區(qū)域并且促進N-Ras基因的轉錄,從而活化RAF/ERK/MEK信號通路來發(fā)揮促進肝癌增殖和轉移的作用。最后我們通過對2組臨床病人的組織檢測接受抗病毒治療前后DNMT1/Fox D3/P54nrb/N-Ras表達量的檢測得出抗病毒治療能夠翻轉該信號通路的表達量,由此我們推測抗病毒治療可能通過抑制該信號通路的活化來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展從而達到一定抗腫瘤的作用。綜上所述,我們研究了病毒感染對促進肝癌發(fā)生發(fā)展,特別是對有特殊基因參與的表觀遺傳調控的作用的分子機制進行了深入而廣泛的探討,為進一步理解該過程中紛繁復雜的信號通路提供了新的思路和視角,為肝癌的抗病毒治療提供了新的思路。第二部分TMED3通過IL-11/STAT3信號通路促進原發(fā)性肝細胞癌進展的機制研究:肝癌是全世界最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在世界范圍內的惡性腫瘤中位居第五位,而死亡率則占腫瘤相關死亡更是高居第三位。隨著外科切除、肝移植以及部分輔助療法的成熟,肝癌五年生存率有了一定程度的提高。但是,肝細胞癌術后復發(fā),肝內、外轉移的風險仍較大。由于肝癌起病隱匿,早期沒有癥狀或癥狀不十分明顯、病程進展迅速,因此確診時大部分病人診斷時既為中晚期,同時更因為血管癌栓、子灶、包膜不全和多中心發(fā)生等情況的存在,缺乏有效的治療,術后仍有很高的復發(fā)轉移率,造成了肝癌預后依然很差。因此,需要全面了解肝癌復發(fā)與轉移的分子生物學機制,探索新的更加有效的治療方法,尋找對預后和治療有指導意義的分子標志物。有文獻報道TMED3在結腸癌中能夠抑制腫瘤的侵襲和轉移,然而TMED3在原發(fā)性肝癌中的表達情況和生物學功能國內外尚未見有系統(tǒng)報道。因此我們的研究旨在為深入了解TMED3在肝癌惡性進展過程中的生物學作用和分子學機制,為臨床肝癌治療提供新的、潛在治療靶點。通過Real-Time PCR和免疫組化技術檢測發(fā)現(xiàn)TMED3在腫瘤組織中的表達量明顯高于癌旁組織,并且我們發(fā)現(xiàn)TMED3的高表達與有侵襲性的臨床病理特征密切相關,TMED3高表達的病人術后的無瘤生存時間(RFS,P=0.0128)和總體生存時間(OS,P=0.0155)都明顯低于TMED3低表達的病人,多因素分析顯示TMED3高表達是影響肝癌病人術后預后的獨立危險因素。體外細胞學實驗證實,TMED3能夠顯著的促進肝癌細胞侵襲和轉移能力,但是對于細胞的增殖能力沒有任何影響。裸鼠體內實驗證實TMED3對肝癌細胞體內成瘤沒有影響,可以促進肝癌細胞轉移到肺部成瘤能力。接下來我們利用表達譜芯片和一系列的分子學實驗發(fā)現(xiàn)TMED3上調IL-11的表達、誘導IL-11的自分泌、活化IL-11/STAT3信號通路�？傊�,我們通過對大規(guī)模肝癌臨床樣本分析,發(fā)現(xiàn)TMED3的表達與病人預后顯著相關;機制方面,我們發(fā)現(xiàn)TMED3通過影響IL-11/STAT3信號通路調控肝癌的侵襲和轉移;我們的研究發(fā)現(xiàn)了一個潛在的肝癌治療靶點,為肝癌治療提供了新的思路。
[Abstract]:絎竴閮ㄥ垎鑲濈値鐥呮瘨鎰熸煋璋冩帶鑲濈檶澧炴畺鍜岃漿縐諱綔鐢ㄥ拰鏈哄埗鐨勭爺絀，

本文編號：1774033