本文選題：氧化吡啶巰基鎳 + 凋亡��； 參考：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：獲得性伊馬替尼耐藥以慢性粒細胞白血病患者細胞內(nèi)Bcr-Abl突變作為特征,這種突變抑制了伊馬替尼與酪氨酸激酶結(jié)合。Bcr-Abl T315I位點突變是獲得性伊馬替尼耐藥的主要機制。因此,尋找克服伊馬替尼耐藥的治療方法和靶向策略是目前急需的。我們最近已經(jīng)報道,氧化吡啶巰基鎳(Nickel pyrithione,NiPT)能夠通過19S蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶(USP14和UCHL5)靶向抑制作用,抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng),但這并不影響20S蛋白酶體功能。因此,接下來,我們將進一步探討:(1)NiPT不僅能夠誘導(dǎo)伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型細胞產(chǎn)生凋亡,還能夠抑制裸鼠移植瘤生長;(2)NiPT通過下調(diào)Bcr-Abl mRNA水平及蛋白酶體抑制作用誘導(dǎo)caspase激活,從而下調(diào)Bcr-Abl表達;(3)19S蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶抑制作用介導(dǎo)caspase激活和細胞凋亡。這些結(jié)果表明,NiPT通過Bcr-Abl依賴與非依賴機制,克服伊馬替尼耐藥,為慢性粒細胞白血病的治療提供了重大的臨床意義。為此,本課題以氧化吡啶巰基鎳(Nickel Pyrithione,NiPT)在慢性粒細胞白血病伊馬替尼敏感型和伊馬替尼耐藥型細胞中的作用展開了具體的探討,進行如下實驗:1、NiPT降低IM-敏感型和IM-T315I突變型細胞活力分別在以下細胞中使用不同濃度的NiPT作用48小時:伊馬替尼敏感型細胞系KBM5、BaF3-p210-WT,伊馬替尼耐藥型Bcr-Abl-T315I突變型細胞系KBM5R和BaF3-p210-T315I細胞,及Bcr-Abl野生型細胞系K562細胞。所有慢性粒細胞白血病細胞活力均有明顯的劑量依賴性降低,50%抑制濃度(IC50)在KBM5、KBM5R、BaF3-p210-WT、BaF3-p210-T315I及K562細胞中分別是0.14,0.17,0.3,0.16和0.98μM。用臺盼藍染色法進一步檢測NiPT對慢性粒細胞白血病細胞的活力效應(yīng)。所有的細胞系的細胞活性均呈時間和劑量依賴性的抑制,這反映了NiPT在慢性粒細胞白血病細胞中的抗腫瘤活性。2、NiPT誘導(dǎo)IM-敏感型和IM-T315I突變型細胞凋亡我們評估NiPT誘導(dǎo)IM-敏感型和IM-T315I突變型細胞死亡的能力。不同濃度的NiPT處理KBM5、KBM5R、K562、BaF3-p210-WT及Ba F3-p210-T315I細胞后,通過在倒置熒光顯微鏡記錄Annexin V/PI雙陽性細胞數(shù),我們觀察到細胞時間依賴性死亡的比例不斷增加。這些結(jié)果均支持NiPT誘導(dǎo)細胞凋亡這一結(jié)論。3、NiPT誘導(dǎo)細胞凋亡與caspase激活及抗凋亡蛋白表達下調(diào)相關(guān)為了探索NiPT誘導(dǎo)慢性粒細胞白血病細胞凋亡的機制,不同時間及濃度的NiPT處理IM-敏感型和IM-T315I突變型細胞后,我們對凋亡相關(guān)蛋白的表達水平進行了檢測。NiPT能夠顯著地增加細胞凋亡標(biāo)志蛋白PARP的切割。同時,數(shù)據(jù)表明NiPT劑量和時間依賴性地激活了caspase 3、caspase 8和caspase 9級聯(lián)反應(yīng)。線粒體是細胞凋亡的調(diào)節(jié)中樞,這是一個被廣泛接受的概念。因此我們接下來研究NiPT是否影響細胞線粒體膜的完整性。研究結(jié)果表明,用NiPT處理所有慢性粒細胞白血病細胞后,其線粒體膜的完整性均有下降。細胞色素C(Cytochrome C)和細胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)從線粒體內(nèi)釋放到細胞質(zhì)中,這一過程被公認為凋亡的早期標(biāo)志。因此我們認為NiPT觸發(fā)了線粒體途徑,且Cyto C和AIF的釋放增加發(fā)生于較早的時間點,這表明NiPT激活了慢性粒細胞白血病細胞的線粒體凋亡通路。為了進一步探討NiPT誘導(dǎo)凋亡的機制,我們還檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果表明,抗凋亡蛋白Mcl-1,XIAP,Bcl-2和Survivin的表達明顯下降。4、NiPT誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細胞凋亡相關(guān)可以確定的是,去泛素化酶或蛋白酶體的抑制作用均導(dǎo)致泛素化蛋白質(zhì)的聚集。與我們先前在其他癌癥細胞中曾報道的類似,在慢性粒細胞白血病細胞中,NiPT劑量和時間依賴性地誘導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)(Ubs)和蛋白酶體底物蛋白p27的積累,這種現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)在PARP切割之前。特別地是,Ni PT并不改變KBM5、KBM5R細胞的20S蛋白酶體活性。蛋白酶體抑制劑,硼替佐米,作為20S蛋白酶體抑制劑的陽性對照。根據(jù)我們之前的報道,NiPT可以以19S蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶作為靶點,有效地抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)。在KBM5R細胞裂解液中,NiPT能夠與HA-UbVS競爭性結(jié)合USP14和UCHL5位點。此外,USP14的磷酸化水平也有大幅減少,這也表明了NiPT對USP14的去泛素化酶活性抑制作用。泛素化蛋白質(zhì)的聚集會導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)和細胞凋亡。NiPT誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER-stress)實驗表明,在KBM5和KBM5R細胞中,NiPT激活了PERK相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,p-eIF2a表達水平的升高是最好證明。這些結(jié)果均表明,NiPT在慢性粒細胞白血病細胞中介導(dǎo)的蛋白酶體抑制在其所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和caspase激活中起了重要作用。5、NiPT下調(diào)Bcr-Abl蛋白表達水平,并抑制其下游信號通路我們發(fā)現(xiàn),NiPT能夠劑量和時間依賴性地下調(diào)IM-敏感型和IM-T315I突變型細胞中總的和磷酸化的Bcr-Abl蛋白水平。進一步研究顯示NiPT影響了Bcr-Abl下游靶蛋白的表達水平。STAT5,Akt和Crkl的磷酸化水平也呈劑量和時間依賴性降低,這發(fā)生于其總體蛋白水平下調(diào)之前。6、Bcr-Abl基因表達水平減少及caspase切割導(dǎo)致Bcr-Abl蛋白水平下調(diào)為了探討NiPT在慢性粒細胞白血病細胞中所介導(dǎo)的Bcr-Abl表達水平下調(diào)的機制,我們分析了Bcr-Abl融合基因的轉(zhuǎn)錄水平。使用不同濃度的NiPT處理KBM5、KBM5R細胞6小時,RT-PCR結(jié)果顯示Bcr-Abl的mRNA水平在一定程度上有所下降。雖然Bcr-Abl的mRNA水平降低程度明顯低于相應(yīng)蛋白水平的降低,但NiPT所致Bcr-Abl mRNA表達水平下調(diào)可能有助于對Bcr-Abl蛋白的減少。為了進一步研究這個問題,我們對RNA聚合酶II(RNA pol II)進行了分析。RNA聚合酶II的磷酸化水平在一定程度上是減少的。NiPT抑制RNA聚合酶的表達,從而下調(diào)包括Bcr-Abl突變型細胞的Bcr-Abl mRNA水平和蛋白水平。有報道稱,Bcr-Abl可以被caspase切割。為了進一步探討NiPT下調(diào)Bcr-Abl表達的機制,我們對Bcr-Abl與caspase活化之間的聯(lián)系進行了研究。我們觀察到,泛-caspase抑制劑ZVAD能夠大部分逆轉(zhuǎn)NiPT介導(dǎo)的細胞死亡及Bcr-Abl的下調(diào),卻不能夠反轉(zhuǎn)泛素化蛋白質(zhì)的聚集。這表明,NiPT通過抑制蛋白酶體活性,激活caspase級聯(lián)反應(yīng),從而下調(diào)Bcr-Abl及其下游通路的表達。7、NiPT在慢性粒細胞白血病原發(fā)性單核細胞中的體外活性研究接下來,我們進一步研究NiPT在12例慢性粒細胞白血病病人骨髓標(biāo)本中的抗腫瘤作用(其中4例為IM-耐藥病人)。結(jié)果顯示,NiPT抑制病人原發(fā)性單核細胞活力,其IC50值在0.58μM到0.82μM之間。NiPT處理36小時后,流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示NiPT劑量依賴性誘導(dǎo)病人原發(fā)性單核細胞凋亡。同時,NiPT還能夠顯著地增加病人細胞中泛素化蛋白質(zhì)及蛋白底物IκB-α聚集,激活caspase-3和caspase-9,減少PARP切割。這些結(jié)果表明,NiPT對病人原發(fā)性單核細胞的抑制作用與體外細胞系作用相一致,提示NiPT對慢性粒細胞白血病病人的潛在治療作用。8、NiPT抑制IM-敏感型和IM-耐藥型裸鼠移植瘤生長接下來,我們檢測NiPT在裸鼠移植瘤中的應(yīng)用。皮下接種KBM5和KBM5R細胞于裸鼠體內(nèi)。與正常對照組相比,NiPT處理組中腫瘤的生長顯著下降。且裸鼠體重相對穩(wěn)定。藥物處理組中Bcr-Abl及其下游靶點Akt、STAT5的表達均有明顯地下調(diào);泛素化蛋白質(zhì)和泛素化蛋白底物P27明顯聚集,提示NiPT能夠同時抑制IM敏感型和IM耐藥型細胞移植瘤的生長。同時,對增殖、分化、粘附相關(guān)標(biāo)志蛋白,Ki67、CD11b/c和CXCR4的檢測發(fā)現(xiàn),NiPT能下調(diào)其蛋白表達。這些結(jié)果表明,NiPT能夠有效抑制IM敏感型和IM耐藥型裸鼠移植瘤生長。結(jié)論:NiPT通過下調(diào)Bcr-Abl轉(zhuǎn)錄水平和蛋白酶體抑制介導(dǎo)的caspase激活切割Bcr-Abl從而減少Bcr-Abl野生型和Bcr-Abl-T315I突變型細胞中Bcr-Abl的表達。同時,19S蛋白酶體相關(guān)去泛素化酶抑制作用在NiPT誘導(dǎo)的caspase激活和細胞凋亡中起著關(guān)鍵作用。我們在這里提出了一種通過下調(diào)Bcr-Abl表達從而克服伊馬替尼耐藥的非傳統(tǒng)治療方案,為慢性粒細胞白血病克服伊馬替尼耐藥的治療提供重大的臨床意義。此部分研究內(nèi)容已經(jīng)在《J Hematology Oncology》上發(fā)表,可以為今后NiPT的臨床試驗以及臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R733.7

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本文編號：1766599