本文選題：整合素avβ6　切入點(diǎn)：免疫脂質(zhì)體　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景結(jié)腸癌是全世界發(fā)病率第三位的惡性腫瘤,而病死率在所有惡性腫瘤中位于第四位。根治性手術(shù)治療仍然是結(jié)腸癌的首選治療方法,而對于淋巴結(jié)陽性和存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Ⅲ期及以上結(jié)腸癌患者,手術(shù)聯(lián)合以5-氟尿嘧啶(5-FU)為基礎(chǔ)的輔助化療相對于單純手術(shù)治療而言能夠?qū)⒔Y(jié)腸癌病死率降低25%,從而顯著提高結(jié)腸癌的5年生存率。然而,結(jié)腸癌患者中對化療敏感的僅占100%～20%,這嚴(yán)重影響了結(jié)腸癌化療效果。因此,研究和探索化療新策略以提高化療在結(jié)腸癌中的療效對于改善結(jié)腸癌病死率和提高生存率方面有十分重要的意義。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇在水中分散形成的具有類似細(xì)胞雙分子層結(jié)構(gòu)的膜性小泡,將化療藥物包封在脂質(zhì)體中可以起到藥物載體的作用。脂質(zhì)體裝載藥物后,其特有的雙層膜結(jié)構(gòu)可以對藥物起到保護(hù),藥物穩(wěn)定性得以提高。同時(shí),也可以延緩藥物的代謝和排泄,從而延長藥物作用時(shí)間。起初脂質(zhì)體并未應(yīng)用于藥物載體,而是用于研究生物膜系統(tǒng),后來隨著研究的深入和擴(kuò)展以及脂質(zhì)體制備工藝的完善,加之其無毒性和免疫原性等特性,脂質(zhì)體成為了理想的藥物載體。作為藥物載體,脂質(zhì)體具有降低用藥劑量、提高治療效果和減輕毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。目前,各種脂質(zhì)體制劑已廣泛用于臨床中疾病的治療,尤其是在腫瘤化療領(lǐng)域。但是由于血液循環(huán)中白蛋白、抗體、調(diào)理素等的作用破壞了脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu),影響了其穩(wěn)定性,導(dǎo)致內(nèi)封藥物滲漏,無法達(dá)到藥物理想的化療效果。為此,人們將親水性的聚乙二醇(PEG)修飾于普通脂質(zhì)體表面進(jìn)而合成了一種長循環(huán)脂質(zhì)體,該脂質(zhì)體能夠逃避血漿中調(diào)理素與其結(jié)合從而避免被巨噬細(xì)胞攝取,從而提高自身的穩(wěn)定性,最終延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,藥物在血液循環(huán)中的半衰期也明顯提高。同時(shí),對于腫瘤病變,局部毛細(xì)血管通透性增加,長循環(huán)脂質(zhì)體作為藥物載體能增加化療藥物在腫瘤組織內(nèi)的蓄積,從而提高了藥物的療效。但是,長循環(huán)脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞的相互作用是被動(dòng)的、非特異性的,導(dǎo)致所載藥物不僅被腫瘤組織細(xì)胞攝取,還會(huì)滲透到周圍正常組織,最終降低藥物治療效果以及增加毒副作用。免疫脂質(zhì)體(immunoliposomes)是將單克隆抗體或其片段連接于長循環(huán)脂質(zhì)體表面而合成的具有特異性識(shí)別靶細(xì)胞能力的特殊類型脂質(zhì)體,其借助抗體與靶細(xì)胞表面抗原特異性的識(shí)別作用,準(zhǔn)確與靶細(xì)胞結(jié)合并將藥物特異性運(yùn)輸至靶細(xì)胞內(nèi)。免疫脂質(zhì)體不僅具有一般長循環(huán)脂質(zhì)體生物穩(wěn)定性好的特點(diǎn),更具有主動(dòng)識(shí)別靶向細(xì)胞的優(yōu)勢。因此,免疫脂質(zhì)體是理想的腫瘤靶向藥物載體。到目前為止,已經(jīng)研發(fā)和報(bào)道了針對CD30,HER2/neu,EGFR和VEGFR等多種腫瘤特異性抗原靶點(diǎn)的免疫脂質(zhì)體,研究證實(shí),這些免疫脂質(zhì)體能夠顯著提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。整合素αvβ6是僅在上皮組織表達(dá)的一種整合素亞型,通過與其受體結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的聯(lián)系。該整合素在胚胎發(fā)生、組織修復(fù)以及腫瘤組織中表達(dá)升高,而在健康上皮組織細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。對于結(jié)腸癌,整合素αvβ6特異性的表達(dá)于腫瘤組織,但是在周圍正常組織沒有表達(dá)。同時(shí),整合素αvβ6的表達(dá)與結(jié)腸癌的病理類型、分化程度、TNM分期密切相關(guān),并且結(jié)腸癌腫瘤組織整合素αvβ6陽性的患者生存期明顯縮短,其表達(dá)可作為結(jié)腸癌不良預(yù)后指標(biāo)。在化療耐藥方面,整合素αvβ6可以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞抵御調(diào)亡和產(chǎn)生耐藥性的能力。因此,鑒于其在結(jié)腸癌組織表達(dá)的特異性以及其在結(jié)腸癌惡性行為中的作用,整合素αvβ6無疑是結(jié)腸癌化療的優(yōu)良靶點(diǎn)。整合素αvβ6已經(jīng)作為臨床生物標(biāo)志物用于胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤的早期檢測。此外,針對整合素αvβ6信號通路的阻斷劑也已用于多種腫瘤的靶向治療。然而,將整合素αvβ6作為藥物載體系統(tǒng)的靶點(diǎn),用于提高結(jié)腸癌化療效果的研究尚未見報(bào)道。本研究中,我們合成制備了以整合素αvβ6為靶點(diǎn)的免疫脂質(zhì)體,并對其藥物包封率、粒徑等性質(zhì)進(jìn)行了檢測。同時(shí)通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作為藥物載體在提高5-FU對結(jié)腸癌化療效果中的作用。第一部分整合素αvβ6靶向免疫脂質(zhì)體的制備及其相關(guān)性質(zhì)檢測目的制備以整合素αvβ6為靶點(diǎn)的免疫脂質(zhì)體,并對其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行檢測。方法采用逆向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備聚乙二醇化的脂質(zhì)體(PEG-脂質(zhì)體),然后應(yīng)用后嵌入的方法將整合素αvβ6單克隆抗體通過交聯(lián)劑與脂質(zhì)體表面的帶有氨基修飾的PEG連接,從而制得抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體。采用激光粒度儀、掃描電鏡分析脂質(zhì)體的粒徑和電位大小。制備裝載5-FU的抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體制劑,高效分光光度儀分析抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體的藥物包封率及體外藥物釋放率。結(jié)果抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體呈球型或半球形,分散均勻;脂質(zhì)體平均粒徑為405.1±2.74nm,Zeta點(diǎn)位為-8.18±1.83mV。分光)光度儀分析該免疫脂質(zhì)體的5-FU包封率為75.95%±2.30%,體外釋放曲線顯示抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體在PBS和血清中具有與PEG-脂質(zhì)體相似的緩釋性,96h釋放分別可達(dá)90%和50%以上。同時(shí),介質(zhì)的pH值對抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體釋放率的影響較小。結(jié)論本部分證實(shí)首先應(yīng)用逆向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備聚乙二醇化的脂質(zhì)體(PEG-脂質(zhì)體),然后將整合素αvβ6單克隆抗體通過交聯(lián)劑后嵌入脂質(zhì)體表面制備抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體是一種可行的方法。并且,制備的裝載5-FU的抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體制劑具有較高的藥物包封率和較好的體外釋放率。第二部分整合素αvβ6靶向免疫脂質(zhì)體對結(jié)腸癌細(xì)胞的靶向效應(yīng)和抗腫瘤效果研究目的研究抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體對結(jié)腸癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用,同時(shí)探討抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體作為藥物載體提高化療藥物抗腫瘤效果的機(jī)制。方法1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480表面整合素αvβ6的表達(dá)情況。2.按照第一部分的方法制備裝載香豆素-6的抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體:熒光倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀分析結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480β6對整合素αvβ6靶向脂質(zhì)體的攝取情況。3.利用Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)實(shí)驗(yàn)測定裝載5-FU的抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體制劑對結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性。4.流式細(xì)胞技術(shù)分析裝載5-FU的抗αv36-免疫脂質(zhì)體對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。5.Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測 Cytochrome C、Caspase-9/3、Cleaved caspase3、Cleaved PARP等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;Caspase活性試驗(yàn)分析處理后結(jié)腸癌細(xì)胞Caspase活性變化。結(jié)果1.在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29中,與未處理組(untreated)和空白質(zhì)粒對照組(Con-siRNA)相比,β6干擾組(β6-siRNA)的HT-29細(xì)胞整合素αvβ6的表達(dá)明降低。而對于整合素αvβ6陰性的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480,β6轉(zhuǎn)染組(β6 transfected)相較于野生型(wild type)和對照組(Mock transfectant),整合素αvβ6的表達(dá)明顯升高。2.對于整合素αvβ6表達(dá)陽性的結(jié)腸癌HT-29和SW480β6細(xì)胞,細(xì)胞對抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體的攝取明顯高于PEG-脂質(zhì)體。然而,對于整合素αvβ6表達(dá)降低或者陰性的結(jié)腸癌HT-29(β6-siRNA轉(zhuǎn)染組)和SW480細(xì)胞,細(xì)胞對抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體的攝取低于HT-29和SW480β6細(xì)胞。3.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,裝載5-FU的抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體較PEG-脂質(zhì)體能夠顯著抑制結(jié)腸癌HT-29和SW480β6細(xì)胞的活性,同時(shí)明顯降低5-FU的半數(shù)抑制濃度。4.流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,對于結(jié)腸癌HT-29和SW480β6細(xì)胞,抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組的細(xì)胞凋亡率分別為21.91%±1.62%和26.18%±2.43%,明顯高于PEG-脂質(zhì)體組的14.53%±0.99%和16.61%±1.23%,以及游離5-FU組的 8.99±1.00%和 12.77±1.21%。5.在抗 αvβ6-免疫脂質(zhì)體組,細(xì)胞凋亡蛋白Cytochrome C、Cleaved caspase-3以及Cleaved PARP的表達(dá)明顯升高,同時(shí)Caspase-9和Caspase-3的活性也顯著提高。結(jié)論抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體能夠明顯增強(qiáng)與整合素αvβ6陽性結(jié)腸癌細(xì)胞的相互作用,從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取。同時(shí),抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體可以顯著提高5-FU誘導(dǎo)結(jié)癌凋細(xì)胞凋亡的作用。其機(jī)制可能與CytochromeC-Caspase-9/3線粒體凋亡通路的活化增強(qiáng)相關(guān)。第三部分整合素αvβ6靶向脂質(zhì)體在體內(nèi)對結(jié)腸癌的靶向效應(yīng)和抗腫瘤效果研究目的研究抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體在體內(nèi)對藥物的主動(dòng)靶向運(yùn)輸作用,以及抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體作為化療藥物載體對結(jié)腸癌的化療效果的影響。方法1.BALB/c裸鼠分別皮下注射結(jié)腸癌HT-29和SW480β6細(xì)胞系,建立裸鼠結(jié)腸癌異種移植瘤模型。2.選取腫瘤體積≥100mm3的結(jié)腸癌荷瘤裸鼠,隨機(jī)分為3組,分別經(jīng)尾靜脈注射游離5-FU、5-FU-PEG-脂質(zhì)體以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體(5-FU濃度為20mg/kg)。于注射后的不同時(shí)間點(diǎn)處死裸鼠,取裸鼠心、肝、脾、肺、腎以及腫瘤組織,高效液相色譜法分析5-FU在各組織中的濃度。3.選取腫瘤體積≥50mm3的結(jié)腸癌附瘤裸鼠,隨機(jī)分成5個(gè)組,分別經(jīng)尾靜脈注射游離5-FU、5-FU-PEG-脂質(zhì)體以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體(5-FU濃度為20mg/kg),空載抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體和生理鹽水作為對照組,每周注射2次,持續(xù)3周,期間測量裸鼠腫瘤體積和裸鼠體重。3周后,處死裸鼠,摘取腫瘤并稱重。分析抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體的腫瘤抑制率和毒副作用。4.TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測各處理組裸鼠結(jié)腸癌移植瘤組織中細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果1.高效液相色譜法分析結(jié)果顯示,在游離5-FU組,心、肝和腎臟組織中含有較高濃度的5-FU。對PEG-脂質(zhì)體和抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組,心、肝和腎臟組織中5-FU的濃度明顯降低。在腫瘤組織中,PEG-脂質(zhì)體和抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組都含有較高濃度的5-FU,但是,隨著時(shí)間的延長,抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組5-FU的濃度逐漸升高,12小時(shí)后達(dá)到最大值,而PEG-脂質(zhì)體組該濃度則逐漸降低�？功羦β6-免疫脂質(zhì)體組腫瘤組織濃度時(shí)間曲線下面積(AUC0-24)為 39.28±0.80μg/g*h,PEG-脂質(zhì)體組的 AUC0_24 為10.42±0.62μg/g*h,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.相對于游離5-FU組,5-FU-PEG-脂質(zhì)體以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組能夠顯著抑制腫瘤的生長。然而,抗αv(36-免疫脂質(zhì)體比PEG-脂質(zhì)體史能夠促進(jìn)5-FU對腫瘤生長的抑制作用。相對應(yīng)的,PEG-脂質(zhì)體組的腫瘤重量是抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組的3倍,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.游離5-FU組中,裸鼠體重降低程度明顯高于抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體組和PEG-脂質(zhì)體組。4.TUNEL試驗(yàn)結(jié)果顯示,相對于游離5-FU組,5-FU-PEG-脂質(zhì)體,5-FU-抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體具有更高的腫瘤細(xì)胞凋亡率。結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)揭示,抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體能夠促進(jìn)所載藥物在結(jié)腸癌組織聚積,從而提高化療藥物的抗腫瘤效果,同時(shí),其又能夠減少藥物在心臟、肝臟以及腎臟等組織中的濃度,一定程度上降低了藥物的對正常臟器的毒副作用。在抑制腫瘤方面,抗αvβ6-免疫脂質(zhì)體載藥后能有效抑制荷瘤體積的生長,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。不僅如此,其對治療裸鼠體重的影響較小,所以也反映出該靶向脂質(zhì)體在控制藥物副作用方面的優(yōu)勢。
[Abstract]:A long - circulation liposome is prepared by dispersing hydrophilic polyethylene glycol ( PEG ) on the surface of common liposome and improving its stability . In addition , the integrin 偽v尾6 has been used as a target for the treatment of colon cancer . The integrin 偽v尾6 has been used as a target for the treatment of colon cancer . The expression of integrin 偽v尾6 in colon cancer cell line HT - 29 and SW480 尾6 was significantly lower than that of untreated group ( untreated group ) and control group ( Con - siRNA ) . 5 - FU , 5 - FU - PEG - liposome and 5 - FU - anti - 偽v尾6 - immunoliposome ( 5 - FU concentration 20 mg / kg ) were injected into 5 - FU group , 5 - FU - PEG - liposome and 5 - FU - anti - 偽v尾6 - immunoliposome group .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

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1 Tao Hu;Zhen Li;Chun-Ying Gao;Chi Hin Cho;;Mechanisms of drug resistance in colon cancer and its therapeutic strategies[J];World Journal of Gastroenterology;2016年30期

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本文編號：1721937