本文選題：miR-27a　切入點：PHLPP2　出處：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：背景:胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近來雖然胃癌預防診治方面的進步增加了早期胃癌的存活率,但晚期胃癌是不可治愈的,死亡率仍然很高。胃癌細胞的過度增殖、侵襲轉移、術后復發(fā)是胃癌患者死亡的主要原因。胃癌的發(fā)生是一個多因素參與、多步驟完成的生物化學變化過程。其過程涉及多個分子作用機制。因此探索闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制有著重要的意義。令人信服的證據(jù)已經證實mi RNAs能夠調節(jié)大多數(shù)腫瘤相關的生物學行為,包括細胞增殖、凋亡、分化、轉移等。一般來說,mi RNAs通過抑制靶基因來行使它的功能。Micro RNA-27a(mi R-27a)在不同腫瘤中的作用是不同的。在一些腫瘤中它被認為是促癌的,例如骨肉瘤、喉癌。然而,在食管鱗狀細胞癌和結腸癌中它被認為是抑癌的。越來越多的證據(jù)表明,mi R-27a在腫瘤的發(fā)生和進展中起著重要的作用,然而mi R-27a在胃癌中的作用還不清楚。mi R-27a在胃癌中的功能和其分子機制需要深入地探索。PH Domain Leucine-rich Repeat Protein Phosphatase2(PHLPP2)是一種蛋白磷酸酶,發(fā)揮著抑癌作用。它被報道可以引起細胞周期阻滯和凋亡并且在多種癌癥中抑制腫瘤的轉移。PHLPP2可以對Akt進行去磷酸化作用,進而抑制PI3K/Akt信號通路。在這里,我們探索了PHLPP2是否是mi R-27a的靶基因。我們的研究表明了mi R-27a在胃癌中通過靶向PHLPP2調控Akt通路來行使其促進胃癌細胞增殖和轉移的功能。方法:應用Real-time PCR的方法來檢測胃癌組織和胃癌細胞中mi R-27a和它的靶基因的表達水平。Mi R-27a在胃癌中的功能通過體外和體內實驗來檢測(MTT實驗、克隆形成實驗、流式細胞術、劃痕愈合實驗、transwell遷移和侵襲實驗、免疫組化實驗、免疫熒光實驗、Western blot實驗以及裸鼠成瘤實驗)。應用熒光素酶報告實驗對mi R-27a的靶基因進行驗證。結果:第一部分Mi R-27a促進胃癌細胞的增殖和轉移我們發(fā)現(xiàn)mi R-27a在胃癌組織中的表達水平高于與之相對應的癌旁組織。高水平的mi R-27a與腫瘤的臨床分期、浸潤、淋巴結轉移和遠端轉移有關。在胃癌細胞系中mi R-27a的表達水平也普遍升高。我們選擇mi R-27a表達相對較高和相對較低的SGC-7901和AGS細胞系進行后續(xù)的實驗。我們進一步進行了相關的功能實驗,來研究mi R-27a對胃癌細胞惡性生物學行為的影響。在SGC-7901細胞中,下調mi R-27a可以抑制胃癌細胞的增殖、克隆形成、劃痕愈合、transwell遷移侵襲以及抑制胃癌細胞的EMT,使細胞周期阻滯,促進凋亡,同時影響Akt通路的相關蛋白的表達。在AGS細胞中,上調mi R-27a可以得到相反的結果。而且,裸鼠成瘤實驗也顯示下調mi R-27a可以抑制移植瘤的生長和轉移。第二部分Mi R-27a在胃癌中靶向調控PHLPP2為了探索mi R-27a在胃癌中發(fā)揮作用的潛在的分子機制,我們運用生物信息學工具找到了mi R-27a的靶基因和相應的靶點。在預測的靶基因中我們選中了PHLPP2進行研究,因為有報道它在抑制腫瘤發(fā)展和調節(jié)細胞增殖遷移方面有重要的作用。熒光素酶報告實驗顯示在AGS細胞中,轉染了mi R-27a agomirs的細胞與對照組相比,熒光素酶活性顯著下降。在AGS細胞中上調mi R-27a,我們發(fā)現(xiàn)PHLPP2的蛋白水平和m RNA水平均下降。在SGC-7901細胞中下調mi R-27a時,可以看到相反的結果。此外,在胃癌組織中,mi R-27a的表達與PHLPP2成顯著負相關。PHLPP2的低表達與胃癌的臨床分期、浸潤、淋巴結和遠端轉移相關。第三部分Mi R-27a通過靶向PHLPP2調控Akt通路蛋白參與胃癌的進展接下來,我們研究了在胃癌的惡性發(fā)展中,mi R-27a靶向抑制PHLPP2發(fā)揮了何種作用。為了驗證mi R-27a是否通過PHLPP2行使功能,SGC-7901細胞共轉染了mi R-27a antagomir和PHLPP2 si RNA。結果顯示PHLPP2的敲減可以減輕mi R-27a antagomir對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的抑制作用。我們的結果發(fā)現(xiàn)了mi R-27a的下調可以引起p-Akt、Cyclin D1、Vimentin、snail下調,p21、p27和E-cadherin上調,但PHLPP2的敲減可以減弱這些改變。這說明了PHLPP2/Akt軸參與了mi R-27a對胃癌細胞的調控。結論:總的來說,我們目前的研究證實了mi R-27a在胃癌中通過新的靶點PHLPP2發(fā)揮促癌效應。下調mi R-27a能夠抑制多種惡性生物學行為,包括腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。沉默PHLPP2能削弱mi R-27a下調引起的惡性生物學行為的改變。也就是說,mi R-27a能通過抑制PHLPP2調控Akt/GSK3β通路促進胃癌細胞的增殖和遷移。綜上所述,我們的結果表明了mi R-27a在胃癌中發(fā)揮促癌基因的作用,并且闡述了其發(fā)揮作用的可能機制。隨著研究的深入,mi R-27a可能成為胃癌防治的一個新靶標。
[Abstract]:Background: gastric cancer is one of the most common malignant tumor of the digestive system. Although recent advances in diagnosis and treatment of gastric cancer has increased the survival rate of early gastric cancer, but advanced gastric cancer is incurable, mortality is still very high. The excessive proliferation of gastric cancer cell invasion and metastasis, recurrence is the major cause of death in patients with gastric cancer gastric cancer. There is a multi factor, biochemical changes many steps to complete the process. The process involves multiple molecular mechanisms. So the study has important significance to elucidate the molecular mechanism of the occurrence and development of gastric cancer. The compelling evidence has confirmed that MI RNAs can regulate the biological behavior of most tumor related, including cell proliferation, apoptosis, differentiation, metastasis and so on. In general, MI RNAs through the inhibition of target gene to exercise its function of.Micro RNA-27a (MI R-27a) in different tumor cells is different in some. It is believed that tumor promoting cancer, such as osteosarcoma, laryngeal cancer. However, in esophageal squamous cell carcinoma and colon cancer it is considered a tumor suppressor. Increasing evidence suggests that MI R-27a plays an important role in the occurrence and development of tumor, but the role of MI R-27a in gastric carcinoma it is not clear how.Mi R-27a in gastric carcinoma and its molecular mechanism of.PH Domain Leucine-rich Repeat investigated Protein Phosphatase2 (PHLPP2) is a protein phosphatase plays a tumor suppressor role. It is reported that the transfer of.PHLPP2 can induce cell cycle arrest and apoptosis and inhibit tumor in a variety of cancers can be carried on the Akt dephosphorylation, and inhibition of the PI3K/Akt signaling pathway. Here, we explored whether PHLPP2 is the target gene of MI R-27a. Our study indicates that MI and R-27a in gastric cancer by targeting PHLPP2 in the regulation of Akt pathway To exercise its promoting cell proliferation and metastasis of gastric carcinoma. Methods: Real-time PCR method was used to detect gastric cancer and gastric cancer cell lines mi R-27a and its target gene expression level of.Mi R-27a in gastric carcinoma function detected by in vitro and in vivo (MTT experiment, clone formation assay, flow cytometry. Wound healing assay, invasion and migration experiment, Transwell immunohistochemistry, immunofluorescence assay, Western blot assay and nude mice). To verify the application of target gene luciferase reporter experiments on MI R-27a. Results: in the first part, Mi R-27a promotes gastric cancer cell proliferation and metastasis we found that the expression level of MI R-27a in gastric cancer higher than that in the corresponding adjacent tissues. The clinical Mi high level of R-27a and tumor staging, infiltration, lymph node metastasis and distant metastasis. In gastric cancer cells mi R-2 The expression of 7a was also increased. We choose mi R-27a for subsequent experimental expression of relatively high and low SGC-7901 and AGS cell lines. We further investigated the function of experiment, to study the effect of MI R-27a on the biological behavior of gastric carcinoma cells. In SGC-7901 cells, down-regulation of MI R-27a can inhibit gastric cancer cells the proliferation, clone formation, wound healing, Transwell migration and invasion and inhibition of gastric cancer cell EMT, cell cycle arrest, apoptosis, and expression of related protein Akt pathway. In AGS cells, upregulation of MI R-27a can get the opposite result. Moreover, the nude mice also showed down-regulation of MI can inhibit R-27a tumor growth and metastasis. The second part of Mi R-27a in gastric cancer and targeted expression of PHLPP2 in order to explore the molecular mechanism underlying mi R-27a play a role in gastric carcinoma, we use Bioinformatics tools to find the target gene of MI R-27a and the corresponding target. In the prediction of target genes in our selected PHLPP2 research, because it is reported in the inhibition of tumor development and regulation of cell proliferation and migration plays an important role. Luciferase reporter experiments showed that in AGS cells transfected with R-27a agomirs, compared to mi the cells with the control group, the luciferase activity was significantly decreased in AGS cells. Up regulation of MI R-27a, we found that the PHLPP2 protein level and m level of RNA was decreased. The down-regulation of MI R-27a in SGC-7901 cells, we can see the results instead. In addition, in gastric cancer tissue. The expression of PHLPP2 and MI R-27a into stage. Clinical expression and gastric cancer was negatively related to.PHLPP2 invasion, lymph node and distant metastasis. The next part of Mi R-27a in third by targeting PHLPP2 protein involved in the regulation of Akt pathway in gastric cancer, we In the study of the malignant development of gastric carcinoma, MI R-27a target role to inhibit PHLPP2. In order to verify whether mi R-27a through the PHLPP2 function, SGC-7901 cells were co transfected with the MI R-27a antagomir and PHLPP2 Si RNA. showed that PHLPP2 knockdown can reduce mi R-27a antagomir on apoptosis of gastric cancer cell proliferation, and inhibition of migration and invasion. Our results suggest that the down-regulation of MI R-27a can cause p-Akt, Cyclin D1, Vimentin, p21, p27 and down-regulation of snail, upregulation of E-cadherin, but the PHLPP2 knockdown can reduce these changes. This shows that the PHLPP2/Akt axis participates in the regulation of R-27a MI on gastric cancer cells. Conclusion: in general, our current the study confirmed that MI R-27a in gastric cancer by targeting PHLPP2 new play cancer promoting effect. The down-regulation of MI R-27a can inhibit the malignant biological behavior of tumor cells, including proliferation, migration and invasion The attack. The silencing of PHLPP2 can weaken the MI R-27a down the biological behavior of malignant changes. That is to say, MI R-27a can inhibit PHLPP2 regulation of Akt/GSK3 beta signaling promote the proliferation and migration of gastric cancer cells. In summary, our results suggest that MI R-27a plays a role in promoting cancer gene in gastric cancer, and describes their play may the mechanism of action. With the deepening of the study, MI R-27a may become a new target for gastric cancer prevention.

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1707782