本文選題：缺血性心肌損傷　切入點(diǎn)：TNFAIP8家族　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:心肌缺血再灌注損傷以及不同病因?qū)е碌穆孕乃ナ俏：θ祟惤】档闹匾膊?.2。缺血缺氧的心肌在被恢復(fù)血流灌注后,心肌損傷未減輕反而進(jìn)一步加重在心肌結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面損傷的現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷3。心衰往往由各種疾病引起心肌收縮能力減弱,從而使心臟的血液輸出景減少,不足以滿足機(jī)體的需要,并由此產(chǎn)生一系列癥狀和體征4.5。本課題重點(diǎn)研究腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白 8樣蛋白2(TIPE2)6在心肌缺血再灌注損傷及慢性心衰模型中的作用并進(jìn)一步探討 TIPE2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及以TIPE2為靶點(diǎn)干預(yù)的治療作用。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣蛋白2(TIPE2)是在研究小鼠的自身反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)時(shí)被新發(fā)現(xiàn)的免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子,屬于TNFAIP8家族,正常情況下主要表達(dá)于髓系及淋巴系免疫細(xì)胞,尤其是T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞,具有獨(dú)特的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED),其缺失會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥性疾病,在維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究人員發(fā)現(xiàn),TIPE2可以識(shí)別含有半胱天冬酶8的信號(hào)復(fù)合體,從而負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞受體(TCR)和Toll樣受體(TLR)通路起到抗炎作用7。TIPE2敲除后的細(xì)胞對(duì)TCR和TLR高反應(yīng),并且生成的炎癥因子顯著增加。在人類,TIPE2異常表達(dá)與全身免疫性疾病、糖尿病腎病及乙型肝炎有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)TIPE2與心肌細(xì)胞自噬水平的調(diào)控有關(guān),并且TIPE2可抑制模式識(shí)別受體NOD2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),明確TIPE2在心肌細(xì)胞中的作用及機(jī)制,闡明TIPE2及NOD2之間的相互作用能夠?yàn)闉樾呐K疾病的治療提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究目的:一、在心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型中檢測TIPE2的表達(dá)變化。二、探討TIPE2是否在心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá);在缺氧/復(fù)氧病理?xiàng)l件下體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)情況。三、探討TIPE2在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制,明確TIPE2與心肌細(xì)胞自噬及凋亡的關(guān)系。四、明確TIPE2在心肌缺血再灌注損傷中抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。探討TIPE2與模式識(shí)別受體NOD2的關(guān)系。五、明確慢性心衰中TIPE2的表達(dá)變化及分子調(diào)控機(jī)制六、驗(yàn)證以TIPE2為靶點(diǎn)進(jìn)行的基因治療的作用研究方法:體外實(shí)驗(yàn)研究:1.我們體外實(shí)驗(yàn)培育了心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,通過蛋白印跡(Western blot,WB)檢測在缺氧/復(fù)氧(I/R)條件下心肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中是TIPE2的表達(dá)及變化;2.通過基因芯片檢測TIPE2過表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞I/R損傷的保護(hù)作用及下游分子機(jī)制,明確TIPE2對(duì)心肌細(xì)胞自噬、凋亡等的影響,確TIPE2抑制心肌缺血炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制;3.以巨噬細(xì)胞為工具細(xì)胞,探討TIPE2與模式識(shí)別受體NOD2的關(guān)系,通過免疫共沉淀進(jìn)一步證實(shí)NOD2與TIPE2之間的關(guān)系。MDP刺激巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,通過免疫熒光、WB及Real time PCR檢測I/R條件下NOD2及TIPE2表達(dá)水平,給予shRNA-NOD2轉(zhuǎn)染后檢測NOD2及TIPE2表達(dá)的變化情況。MDP預(yù)處理巨噬細(xì)胞,MAPKs信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路活化水平被通過檢測ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化水平來估測,進(jìn)一步給予pRK5-TIPE2轉(zhuǎn)染后ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化的影響。體內(nèi)(動(dòng)物學(xué))實(shí)驗(yàn)研究:1.在C57BL/6J野生型小鼠分別隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組及手術(shù)組。通過結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支30min,然后再灌注不同的時(shí)間在建立心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測和Western Blot分析TIPE2的表達(dá)變化。2.NOD2敲除小鼠為工具鼠構(gòu)建心肌I/R損傷模型通過WB分析TNFAIP8家族在心肌I/R損傷中表達(dá)水平。3.使用阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰模型,WB表征TIPE2的表達(dá)變化及TIPE2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。4.慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方式在小鼠體內(nèi)抑制或者過表達(dá)TIPE2,明確以TIPE2為靶點(diǎn)的治療在心肌缺血中的作用。用pGLV3-shRNA2-TIPE2轉(zhuǎn)染NOD2-/-小鼠,使TIPE2沉默,通過免疫免疫熒光技術(shù)確定轉(zhuǎn)染效率,小動(dòng)物超聲心動(dòng)圖檢測心肌I/R損傷的小鼠左心室內(nèi)徑及心功能,EB和TTC染色區(qū)分心肌梗死危險(xiǎn)區(qū)范圍及梗死區(qū)范圍;ELISA測定組織的炎癥細(xì)胞因子水平。最后通過LV-TIPE2轉(zhuǎn)染小鼠,通過超聲心動(dòng)圖、EB和TTC染色及ELISA檢測TIPE2過表達(dá)后對(duì)心功能、心肌梗死危險(xiǎn)區(qū)范圍及梗死區(qū)范圍和炎癥細(xì)胞因子水平的影響。結(jié)果:1.TIPE2在心肌缺血再灌注損傷中表達(dá)上調(diào)。2.TIPE2可抑制心肌細(xì)胞中缺血再灌注誘導(dǎo)的自噬水平上調(diào),從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。3.NOD2負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞TIPE2的表達(dá),可以通過改變TIPE2影響NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用。。4.TIPE2在慢性心衰模型中水平下調(diào),進(jìn)一步驗(yàn)證其在心肌細(xì)胞的損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用,同時(shí)結(jié)果顯示,TIPE2的表達(dá)受到SIRT6的調(diào)控。5.慢病毒介導(dǎo)的TIPE2基因過表達(dá)可緩解心肌缺血再灌注損傷。結(jié)論:TIPE2可通過抑制心肌細(xì)胞自噬水平發(fā)揮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,同時(shí)TIPE2在慢性心衰過程中表達(dá)降低,并且SIRT6參與到TIPE2表達(dá)的調(diào)控,以TIPE2為靶點(diǎn)的基因治療可改善心肌缺血再灌注損傷。創(chuàng)新性:本課題首次發(fā)現(xiàn)NOD2負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞TIPE2的表達(dá),可以通過改變TIPE2影響NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用。TIPE2可以抑制通過NOD2信號(hào)通路及自噬水平起到心肌缺血再灌注的保護(hù)作用。首次明確慢性心衰過程中TIPE2表達(dá)降低并且SIRT6參與到TIPE2的表達(dá)調(diào)控。慢病毒介導(dǎo)的TIPE2基因過表達(dá)技術(shù)進(jìn)一步證TIPE2能夠作為干預(yù)靶點(diǎn)對(duì)心肌缺血再灌注損傷進(jìn)行治療,為多種心臟疾病的治療提供新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。
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本文編號(hào)：1668136