本文選題：缺血性心肌損傷　切入點：TNFAIP8家族　出處：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:心肌缺血再灌注損傷以及不同病因?qū)е碌穆孕乃ナ俏：θ祟惤】档闹匾膊?.2。缺血缺氧的心肌在被恢復血流灌注后,心肌損傷未減輕反而進一步加重在心肌結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面損傷的現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷3。心衰往往由各種疾病引起心肌收縮能力減弱,從而使心臟的血液輸出景減少,不足以滿足機體的需要,并由此產(chǎn)生一系列癥狀和體征4.5。本課題重點研究腫瘤壞死因子α誘導蛋白 8樣蛋白2(TIPE2)6在心肌缺血再灌注損傷及慢性心衰模型中的作用并進一步探討 TIPE2的表達調(diào)控機制以及以TIPE2為靶點干預(yù)的治療作用。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣蛋白2(TIPE2)是在研究小鼠的自身反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)時被新發(fā)現(xiàn)的免疫負調(diào)節(jié)因子,屬于TNFAIP8家族,正常情況下主要表達于髓系及淋巴系免疫細胞,尤其是T淋巴細胞、單核細胞或者巨噬細胞,具有獨特的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED),其缺失會引起嚴重的炎癥性疾病,在維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用。研究人員發(fā)現(xiàn),TIPE2可以識別含有半胱天冬酶8的信號復合體,從而負性調(diào)控T細胞受體(TCR)和Toll樣受體(TLR)通路起到抗炎作用7。TIPE2敲除后的細胞對TCR和TLR高反應(yīng),并且生成的炎癥因子顯著增加。在人類,TIPE2異常表達與全身免疫性疾病、糖尿病腎病及乙型肝炎有關(guān)。我們研究發(fā)現(xiàn)TIPE2與心肌細胞自噬水平的調(diào)控有關(guān),并且TIPE2可抑制模式識別受體NOD2介導的炎癥反應(yīng),明確TIPE2在心肌細胞中的作用及機制,闡明TIPE2及NOD2之間的相互作用能夠為為心臟疾病的治療提供理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。研究目的:一、在心肌缺血再灌注損傷動物模型中檢測TIPE2的表達變化。二、探討TIPE2是否在心肌細胞及心臟成纖維細胞中表達;在缺氧/復氧病理條件下體外培養(yǎng)巨噬細胞中TIPE2的表達情況。三、探討TIPE2在心肌細胞缺血再灌注損傷中的作用機制,明確TIPE2與心肌細胞自噬及凋亡的關(guān)系。四、明確TIPE2在心肌缺血再灌注損傷中抑制炎癥反應(yīng)的作用機制。探討TIPE2與模式識別受體NOD2的關(guān)系。五、明確慢性心衰中TIPE2的表達變化及分子調(diào)控機制六、驗證以TIPE2為靶點進行的基因治療的作用研究方法:體外實驗研究:1.我們體外實驗培育了心肌細胞、巨噬細胞等,通過蛋白印跡(Western blot,WB)檢測在缺氧/復氧(I/R)條件下心肌細胞、巨噬細胞中是TIPE2的表達及變化;2.通過基因芯片檢測TIPE2過表達對心肌細胞I/R損傷的保護作用及下游分子機制,明確TIPE2對心肌細胞自噬、凋亡等的影響,確TIPE2抑制心肌缺血炎癥反應(yīng)的作用機制;3.以巨噬細胞為工具細胞,探討TIPE2與模式識別受體NOD2的關(guān)系,通過免疫共沉淀進一步證實NOD2與TIPE2之間的關(guān)系。MDP刺激巨噬細胞及中性粒細胞,通過免疫熒光、WB及Real time PCR檢測I/R條件下NOD2及TIPE2表達水平,給予shRNA-NOD2轉(zhuǎn)染后檢測NOD2及TIPE2表達的變化情況。MDP預(yù)處理巨噬細胞,MAPKs信號通路以及NF-κB信號通路活化水平被通過檢測ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化水平來估測,進一步給予pRK5-TIPE2轉(zhuǎn)染后ERK1/2、p38、JNK、IκBα及p65的磷酸化的影響。體內(nèi)(動物學)實驗研究:1.在C57BL/6J野生型小鼠分別隨機分成假手術(shù)對照組及手術(shù)組。通過結(jié)扎小鼠冠狀動脈左前降支30min,然后再灌注不同的時間在建立心肌缺血再灌注(I/R)損傷模型。實時熒光定量PCR檢測和Western Blot分析TIPE2的表達變化。2.NOD2敲除小鼠為工具鼠構(gòu)建心肌I/R損傷模型通過WB分析TNFAIP8家族在心肌I/R損傷中表達水平。3.使用阿霉素誘導慢性心衰模型,WB表征TIPE2的表達變化及TIPE2的表達調(diào)控機制。4.慢病毒介導的基因轉(zhuǎn)染方式在小鼠體內(nèi)抑制或者過表達TIPE2,明確以TIPE2為靶點的治療在心肌缺血中的作用。用pGLV3-shRNA2-TIPE2轉(zhuǎn)染NOD2-/-小鼠,使TIPE2沉默,通過免疫免疫熒光技術(shù)確定轉(zhuǎn)染效率,小動物超聲心動圖檢測心肌I/R損傷的小鼠左心室內(nèi)徑及心功能,EB和TTC染色區(qū)分心肌梗死危險區(qū)范圍及梗死區(qū)范圍;ELISA測定組織的炎癥細胞因子水平。最后通過LV-TIPE2轉(zhuǎn)染小鼠,通過超聲心動圖、EB和TTC染色及ELISA檢測TIPE2過表達后對心功能、心肌梗死危險區(qū)范圍及梗死區(qū)范圍和炎癥細胞因子水平的影響。結(jié)果:1.TIPE2在心肌缺血再灌注損傷中表達上調(diào)。2.TIPE2可抑制心肌細胞中缺血再灌注誘導的自噬水平上調(diào),從而抑制心肌細胞凋亡。3.NOD2負調(diào)控巨噬細胞TIPE2的表達,可以通過改變TIPE2影響NF-κB信號通路介導的炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用。。4.TIPE2在慢性心衰模型中水平下調(diào),進一步驗證其在心肌細胞的損傷過程中發(fā)揮保護作用,同時結(jié)果顯示,TIPE2的表達受到SIRT6的調(diào)控。5.慢病毒介導的TIPE2基因過表達可緩解心肌缺血再灌注損傷。結(jié)論:TIPE2可通過抑制心肌細胞自噬水平發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用,同時TIPE2在慢性心衰過程中表達降低,并且SIRT6參與到TIPE2表達的調(diào)控,以TIPE2為靶點的基因治療可改善心肌缺血再灌注損傷。創(chuàng)新性:本課題首次發(fā)現(xiàn)NOD2負調(diào)控巨噬細胞TIPE2的表達,可以通過改變TIPE2影響NF-κB信號通路介導的炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用。TIPE2可以抑制通過NOD2信號通路及自噬水平起到心肌缺血再灌注的保護作用。首次明確慢性心衰過程中TIPE2表達降低并且SIRT6參與到TIPE2的表達調(diào)控。慢病毒介導的TIPE2基因過表達技術(shù)進一步證TIPE2能夠作為干預(yù)靶點對心肌缺血再灌注損傷進行治療,為多種心臟疾病的治療提供新的靶點及理論依據(jù)。
[Abstract]:鐮旂┒鑳屾櫙:蹇冭倢緙鴻鍐嶇亴娉ㄦ崯浼や互鍙婁笉鍚岀梾鍥犲鑷寸殑鎱㈡，

本文編號：1668136