本文選題：膿毒癥　切入點：miR-29a　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景膿毒癥為機體感染所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征,其英縮寫為SIRS,膿毒癥患者處于發(fā)病期間,其全身各種組織器官共同參與這一過程。這種疾病在致使重癥監(jiān)護室患者死亡方面排在全球的首位,嚴重威脅患者生命健康,同時亦給社會和家庭帶來子巨大經(jīng)濟壓力,同時生物機體的免疫反應(yīng)亦在該過程中扮演著重要角色。在膿毒癥發(fā)生時,機體同時存在免疫抗擊以及免疫抑制,兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。除此之外,抗炎以及促炎反應(yīng)亦參與了膿毒癥的發(fā)生。膿毒癥發(fā)生的臨床表現(xiàn)往往呈現(xiàn)出多樣性,即沒有其標(biāo)志性的臨床表現(xiàn),因此越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到尋找膿毒癥特異性生物學(xué)標(biāo)志物的研究上來,以期將之應(yīng)用于膿毒癥的臨床診斷、治療以及預(yù)后評價中。迄今為止,已有多種膿毒癥相關(guān)分子標(biāo)志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),其中包括與凝血和炎癥反應(yīng)相關(guān)的分子標(biāo)志物,如C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、降鈣素原等,目前這些分子標(biāo)志物已有部分被應(yīng)用于臨床。但在目前所使用的上述分子標(biāo)志物中均存在敏感性過高以及特異性不強等缺點,因此應(yīng)用于診斷膿毒癥往往結(jié)果并不理想;評分系統(tǒng)雖然能夠用于對膿毒癥患者的預(yù)后情況以及病情的嚴重程度進行評價,但卻不能應(yīng)用于膿毒癥的診斷,同時亦不能夠應(yīng)用于膿毒癥的治療當(dāng)中。所以尋找新的膿毒癥診斷、治療以及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物成為目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。miRNA為一類非編碼小RNA分子,成熟miRNA的長度為18～25個核苷酸,通過生物機體可以快速識別特定目標(biāo)的mRNA,全面調(diào)控mRNA的降解,還可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控其翻譯過程。生物機體中miRNA與一系列生命活動過程相關(guān),其中包括細胞的生長、增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及機體免疫等。目前已有大量研究證實,miRNA與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miR-29為一類miRNA,在人體的肺、腎臟、心臟等組織細胞中呈高表達狀態(tài)。miR-29a為miR-29家族中的重要成員之一,其在生物機體一系列生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用,但目前尚未有miR-29a與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展相關(guān)性的研究。STATs,即以激活因子為中心,進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄,屬于由酪氨酸蛋白激酶活化的轉(zhuǎn)錄因子,存在于細胞漿中,具有介導(dǎo)細胞反應(yīng)性以及增生性信號的功能。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要成員包括JAKs以及STATs蛋白家族。目前的研究已經(jīng)證實,STATs蛋白家族為JAKs的底物,STAT能夠通過促進炎癥介質(zhì)的表達從而影響膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展。STATs蛋白家族能夠通過介導(dǎo)多種細胞因子的表達,從而調(diào)控生物機體中一系列生理過程,其中包括細胞生長、分化、增殖以及凋亡等。STAT3為STATs家族的重要成員之一,在生物機體中STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種生長因子以及細胞因子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程之間存在密切聯(lián)系,從而參與了一系列生理和病理過程。STAT3能夠通過調(diào)控相應(yīng)靶基因,以便加速細胞增殖、有效組織細胞凋亡的速度,改善細胞惡變的現(xiàn)象。不同的JAK/STAT信號通路在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中往往會具有不同作用,其中JAK2/STAT3通路在膿毒癥引起的多器官功能障礙的發(fā)展過程中扮演著十分重要的角色]。通過人為手段阻斷JAK2/STAT3信號通路能夠進而阻斷膿毒癥發(fā)生過程中引起的過激炎癥反應(yīng),此外還能同時抑制機體過度抗炎反應(yīng)的發(fā)生,最終發(fā)揮保護組織器官的功能。目的本研究擬通過檢測miR-29a在膿毒癥患者外周血白細胞中的表達,探討其與膿毒癥患者預(yù)后以及血清中炎性因子的相關(guān)性,同時分析miR-29a表達的改變對LI-10誘導(dǎo)的人外周血單核細胞系THP-1增殖、凋亡以及細胞周期的影響;除此之外,我們還利用生物信息學(xué)軟件對miR-29a的靶基因進行預(yù)測并進行驗證。本研究旨在旨在為了解miR-29a在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制,同時為膿毒癥的臨床診斷,進行靶向治療給予強大的后援。方法(1)選取2015年8月至次年8月期間于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護室(intensive care unit,ICU)收治的膿毒癥患者外周血樣本為對象,共40例;采集同期于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護室(ICU)收治的SIRS患者外周血樣本,共35例;同時采集10例同期于XXX醫(yī)院門診進行健康檢查的健康志愿者外周血樣本,共10例。熒光定量PCR檢測上述血液樣本中mIR-29a的表達水平,ELISA法檢測血清中IL-10和TNF-α的含量。分析miR-29a與IL-10、TNF-α的相關(guān)性。(2)ELISA法檢測不同患者來源的單核細胞以及用20 ng/mL LPS作用后的THP-1細胞中IL-10蛋白的表達情況。設(shè)計并合成miR-29a inhibitor,將之轉(zhuǎn)染THP-1細胞用以抑制細胞中miR-29a的表達。熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中miR-29a的表達量。用20 ng/mLLPS作用于轉(zhuǎn)染后的THP-1細胞,MTT法檢測細胞的增殖活性,Hoechst染色法檢測細胞的凋亡率。(3)將 LPS(20 ng/ml)和 LPS+ IL-10(10 ng/mL)分別作用于 THP-1 細胞,MTT法檢測細胞的存活率,流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率;western blot法檢測細胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表達。運用生物信息學(xué)軟件對miR-29a的靶基因進行預(yù)測。分別構(gòu)建STAT3 3'UTR WT(野生型)和STAT3 3'UTR Mut(突變型)質(zhì)粒載體并將之分別與miR-29amimic共轉(zhuǎn)染HTP-1細胞,檢測細胞中熒光素酶報告基因的表達。將miR-29amimic分別轉(zhuǎn)染來自于健康志愿者外周血的單核細胞以及培養(yǎng)的人單核細胞THP-1,采用熒光定量PCR和western blot法分別檢測上述細胞中STAT3 mRNA和蛋白的表達。將miR-29a和/或STAT3慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細胞,隨后用20 ng/ml LPS作用于上述細胞,流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡率,MTT法檢測細胞的存活率。結(jié)果(1)熒光定量 PCR檢測結(jié)果表明,對照組患者血漿中miR-29a的相對表達量為 0.235±0.110、膿毒癥組患者為 0.733±0.126、SIRS組患者為0.419±0.093。與對照組相比,膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達水平明顯增高(t=3.122,P=0.0350.05);與對照組相比,SIRS組患者血漿中miR-29a的表達水平明顯增高(t=2.091,P=0.0440.05);與SIRS組患者相比,膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達水平明顯增高(t=2.322,P=0.0460.05)。ELISA檢測結(jié)果表明,對照組患者血清中IL-10的表達量為(233.175±25.624)pg/mL、膿毒癥組患者為(549.367±30.098)pg/mL、SIRS 組患者為(331.119±29.033)pg/mL。與對照組相比,膿毒癥組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=4.355,P=0.0290.05);與對照組相比,SIRS組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=3.761,P=0.0410.05);與SIRS組患者相比,膿毒癥組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=2.716,P=0.0430.05)。對照組患者血清中TNF-α的表達量為(189.233±19.259)pg/mL、膿毒癥組患者為(411.189±24.106)?g/mL、SIRS組患者為(290.611±22.735)pg/mL。與對照組相比,膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=6.811,P=0.0230.05);與對照組相比,SIRS組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=4.655,P=0.0380.05);與SIRS組患者相比,膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=4.316,P=0.0440.05)。miR-29a與IL-10呈正相關(guān)(r=0.407,P=0.0410.05);對膿毒癥患者外周血中miR-29a的表達與TNF-α含量之間的相關(guān)性進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果表明miR-29a與 TNF-α 呈正相關(guān)(r=0.576,P=0.0380.05)。ELISA檢測結(jié)果表明,與對照組相比,各膿毒癥患者單核細胞中IL-10的表達量均明顯增高(P0.05)。采用ELISA法對用20 ng/mL LPS作用后THP-1細胞在0、4、8、12 h時IL-10的表達水平進行檢測,結(jié)果表明隨著時間的推移,LPS作用后人單核細胞THP-1中IL-10的表達水平逐漸增高。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,與control組相比,miR-29a inhibitor組細胞含有miR-29a表達能力呈現(xiàn)下降趨勢(P0.05),已經(jīng)順利建立了 THP-1細胞,可以對miR-29a起到表達抑制的效果。經(jīng)過MTT法可以發(fā)現(xiàn),較之于照組顯而言,THP-1細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor以后,其分別于48 h、72 h、96 h的組織率得到很大的提升(P0.05)。Hoechst染色法檢測結(jié)果表明,miR-29a inhibitor組細胞凋亡率明顯低于對照組組(P0.01)。(2)隨著時間的延長,對照組和IL-10作用組細胞中細胞的存活率均逐漸增高;其中相較于對照組,IL-10處理組細胞各時間點的存活率明顯高于對照組(P0.05)。與對照組相比,IL-10作用組細胞凋亡率明顯降低(P0.05)。隨著時間的推移,STAT3和p-STAT3蛋白的表達水平逐漸增高。生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果表明,STAT3為miR-29a的靶基因。與對照組相比,miR-29a mimic與STAT33'UTR WT共轉(zhuǎn)染組已經(jīng)在不斷降低其熒光素酶表達量(P0.05);與對照組對比,miR-29a mimic與STAT3 3'UTR Mut共轉(zhuǎn)染組,兩者的熒光素酶表達量基本不變(P0.05)。在分離自健康志愿者外周血的單核細胞中,當(dāng)miR-29a表達上調(diào)后能夠明顯抑制細胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(P0.05);在培養(yǎng)的人單核細胞THP-1中,當(dāng)miR-29a表達上調(diào)后能夠明顯抑制細胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(P0.05)。與miR-control組相比,miR-29a組細胞的凋亡率明顯增高(P0.05);而miR-control+STAT3組細胞的凋亡率則明顯降低(P0.05);而miR-29a+STAT3組細胞的凋亡率與miR-control組相比無顯著差異(P0.05)。miR-29a組在1、3、4、5 天時細胞的存活率明顯低于 miR-control 組(P0.05);miR-control+STAT3組細胞的存活率明顯高于miR-control組(P0.05);而miR-29a+STAT3組與miR-control組相比無明顯差異(P0.05)。結(jié)論miR-29a在膿毒癥患者外周血中呈高表達狀態(tài),其能夠通過抑制STAT3的表達削弱IL-10對單核細胞的保護作用,從而促進細胞凋亡的發(fā)生以及抑制細胞增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

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本文編號：1651607