本文選題：靜電紡絲　切入點：骨質(zhì)疏松癥　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是在脊柱外科領(lǐng)域最常見和最具挑戰(zhàn)的合并癥之一。由于骨量減少與結(jié)構(gòu)異常,合并骨質(zhì)疏松癥的患者發(fā)生椎間融合器沉降、椎體切割、螺釘拔出、(假關(guān)節(jié)形成導致)釘棒斷裂等內(nèi)固定失敗的例子并不罕見。由各種因素造成的成骨細胞增殖分化功能的下降,導致骨質(zhì)疏松患者在骨修復過程中的愈合能力減弱,愈合時間延長。因此,骨質(zhì)疏松條件下的缺損修復理想上需要長時間的藥物干預。傳統(tǒng)的系統(tǒng)給藥模式存在利用率相對低下的缺點;進入全身循環(huán)的藥物,長期的反復作用還可能升高或直接導致患者出現(xiàn)肝腎功能損害、鈣劑相關(guān)心臟疾病等并發(fā)癥的風險;同時,除了缺損部位的骨填充材料需求,脊柱外科臨床往往還需要應(yīng)用額外的骨組織來幫助實現(xiàn)節(jié)段融合。因此,通過設(shè)計出兼具長期局部控釋抗骨質(zhì)疏松藥物以及良好生物力學強度的復合骨支架材料,可以在對局部骨缺損支撐填充的同時,使藥物在局部微環(huán)境中持續(xù)作用,則能更好的促進骨質(zhì)疏松條件下的骨修復并改善局部骨組織的強度。近年來,他汀類被發(fā)現(xiàn)具有抑制成骨細胞的凋亡,促進成骨細胞分化,促進成骨修復,以及抑制甲羥戊酸途徑從而抑制破骨細胞的分化并調(diào)節(jié)其相關(guān)功能的作用,因此被廣泛認為具有重要的促進骨組織修復的以及抗骨質(zhì)疏松的潛能。然而,他汀類的骨親和力低,局部應(yīng)用發(fā)揮成骨效力又具有濃度依賴性,因此需要選擇適宜的的局部緩釋載體。近年來,靜電紡絲作為緩釋藥物的載體受到青睞,其優(yōu)勢在于經(jīng)濟便捷,載藥容量高,生物相容性好;藥物緩釋持久有效且精確可控。因此,以靜電紡絲作為抗骨質(zhì)疏松藥物的載體具有良好的潛力。然而,盡管靜電紡絲本身可以形成組織支架,但難以作為可以填充支撐的骨組織支架獨立應(yīng)用,需要與傳統(tǒng)骨組織工程支架相聯(lián)合應(yīng)用。本研究通過靜電紡絲技術(shù),將他汀類藥物(洛伐他汀Lovastatin,LOV)與高分子聚合物(聚己內(nèi)酯PCL)搭載形成可緩釋LOV的載藥納米紗的膜片,再與β磷酸三鈣(β-TCP)與PCL結(jié)合形成的的復合骨支架材料,以多層“三明治”的形式裝配形成可長期緩釋載抗骨質(zhì)疏松藥物的支架復合物(eLTPS)。通過調(diào)節(jié)他汀類載藥膜片裝載層數(shù),精確控制局部微環(huán)境的藥物釋放,并在體外細胞實驗中優(yōu)化和證實其促進成骨礦化的能力,并將優(yōu)化篩選的eLTPS直接應(yīng)用于兔的骨質(zhì)疏松動物骨缺損模型中進行外科治療,從而進一步驗證其體內(nèi)的抗骨質(zhì)疏松以及骨修復的能力。以期為骨質(zhì)疏松條件下骨組織缺損的局部修復提供一個新的有效途徑。第一部分:可緩釋抗骨質(zhì)疏松藥物骨組織支架復合物eLTPS的制備及表征目的:通過靜電紡絲技術(shù)制備可緩釋具有抗骨質(zhì)疏松藥物的骨組織支架復合物eLTPS,并觀察測量其物理化學特征,以及表面微觀結(jié)構(gòu)情況。方法:將LOV與PCL溶液在靜電紡絲技術(shù)輔助下制備出共混紡納米紡紗膜片“e LOV/PCL”,再與物理優(yōu)化性能后的β-TCP/PCL支架通過壓配形成e-LOVPCL/β-TCP/PCL復合骨組織支架(eLTPS)。以萬能力學測試機檢測并優(yōu)化復合骨支架材料的抗壓性能,以掃描電鏡觀察復合支架表面的微觀結(jié)構(gòu),以EDS能譜儀檢測材料的化學構(gòu)成。結(jié)果:在靜電紡絲技術(shù)輔助下,我們成功制備了載抗骨質(zhì)疏松藥物的復合骨支架材料eLTPS。各組材料樣本的抗壓性能良好,強度均超過70 MPa,其中β-TCP和PCL的比例為1:1時,抗壓性能較其它組更佳(P＜0.05);EDS能譜進一步證實了材料的化學構(gòu)成;電鏡顯示制備的支架材料表面粗糙,大量分布著可供細胞黏附生長的左右的孔隙,孔隙分布均勻,大小較為均一,孔隙直徑約在250-350μm之間。結(jié)論:通過靜電紡絲技術(shù)實現(xiàn)了抗骨質(zhì)疏松藥物洛伐他汀的精確搭載,在聯(lián)合應(yīng)用β-TCP/PCL復合支架材料后,成功制備出了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的骨組織支架復合物eLTPS。eLTPS裝載不同層數(shù)的靜電紡絲載藥膜片,同時兼具有一定的生物力學強度,理論上適用于骨質(zhì)疏松條件下骨組織缺損的局部修復。第二部分:eLTPS的體外緩釋性能,生物安全性檢測以及對成骨細胞分化功能的影響目的:本部分旨在研究eLTPS的藥物緩釋特性,檢測其材料的生物安全性,以及eLTPS在體外對成骨細胞增殖和成骨功能的影響。方法:將eLTPS置于體外模擬液中,以紫外線分光光度計(UV法)測定緩釋液中LOV的濃度,檢測49天,比較含有不同載藥絲膜層數(shù)eLTPS緩釋LOV的特性,并繪制釋放曲線。將eLTPS與對照組和MC3T3共培養(yǎng)后,以CCK-8法檢驗eLTPS以及各對照組對鼠顱頂成骨細胞MC3T3增殖能力的影響,通過堿性磷酸酶染色以及定量分析來檢測eLTPS對成骨礦化功能的影響,以掃面電鏡動態(tài)觀察成骨細胞在eLTPS上的黏附情況。結(jié)果:各組eLTPS在前3天的釋放量達20%左右,隨后各組材料LOV的釋放速率逐漸減緩。載3層靜電紡絲載藥膜片的eLTPS樣本具有更平緩而穩(wěn)定的釋放曲線,直至測量第49天時LOV釋放量僅為62.5%,仍具備37.5%左右剩余的儲備載藥量,LOV的有效釋放時程可達到49天以上。eLTPS組和對照組MC3T3的總體生長情況良好,培養(yǎng)第1天時,由于LOV短暫爆發(fā)釋放的影響,eLTPS組細胞存活率較對照組稍降低,但差異沒有統(tǒng)計學意義。隨著培養(yǎng)時間的延長,eLTPS組標本成骨細胞增殖水平逐漸升高。細胞毒性評級為1級,制備材料具有良好的生物相容性。堿性磷酸酶染色顯示eLTPS組的堿性磷酸酶活性最高(P＜0.05),染色呈深藍色。掃面電鏡顯示成骨細胞在與eLTPS在共培養(yǎng)1天時即開始出現(xiàn)聚集和表面黏附,細胞伸展性良好。隨著培養(yǎng)時間延長,生長黏附的細胞逐漸增多,并長入材料孔隙內(nèi)部,細胞周圍可見分泌的基質(zhì)形成。結(jié)論:eLTPS具有理想的長程有效控釋LOV的能力。細胞毒性實驗證明了eLTPS具有良好的生物相容性,堿性磷酸酶檢測提示材料具有良好的促進成骨分化和礦化功能。掃面電鏡證實了成骨細胞在eLTPS中的黏附生長的能力。體外細胞實驗的結(jié)果初步驗證了eLTPS作為載抗骨質(zhì)疏松骨支架材料促進局部骨組織愈合的潛能。第三部分:eLTPS在骨質(zhì)疏松性骨缺損模型中的體內(nèi)成骨作用研究實驗一:骨質(zhì)疏松動物模型的建立和驗證目的:構(gòu)建不可逆的兔骨質(zhì)疏松模型,并驗證模型構(gòu)建的有效性。方法:選擇新西蘭兔作為實驗動物,通過雙側(cè)卵巢切除和小劑量激素注射聯(lián)合應(yīng)用(OVX+MPi法),構(gòu)建不可逆的中型骨質(zhì)疏松動物模型。通過Micro-CT檢測模型和對照組兔股骨下段興趣區(qū)域的骨參數(shù)變化,驗證骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建情況。結(jié)果:所有動物模型都存活,無嚴重不良并發(fā)癥。Micro-CT結(jié)果顯示OVX+MPi組骨組織皮質(zhì)變薄,骨小梁稀疏,結(jié)構(gòu)更細,骨小梁之間的分離程度增大。實驗組骨參數(shù):Tn=0.67±0.06 1/mm(P＜0.001),Tb.Th=0.14±0.01 mm(P＜0.01),BV/TV%=13.89%±1.07%(P＜0.05),BMD=161.74±11.58 g/cc(P＜0.001)。OVX+MPi組的各組Micro-CT測得的各關(guān)鍵骨組織參數(shù)都低于作為對照的假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學意義。參考既往文獻,可以認為實驗組骨質(zhì)疏松新西蘭兔模型構(gòu)建成功。結(jié)論:我們通過OVX+MPi法制備了不可逆的骨質(zhì)兔骨質(zhì)疏松動物模型。以Micro-CT檢測實驗組和對照組骨組織標本的微觀結(jié)構(gòu)和定量分析參數(shù),驗證了該模型的成功構(gòu)建。實驗二:eLTPS在兔骨質(zhì)疏松模型中的體內(nèi)成骨作用研究目的:在制備的兔骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)驗證eLTPS對骨質(zhì)疏松性骨缺損的成骨修復能力。方法:以前兔骨質(zhì)疏松模型為實驗對象,按所制備eLTPS材料的形狀截骨制備股骨下段干骺端負重區(qū)域的的骨組織缺損,分別植入eLTPS組和對照組。術(shù)后4周和12周時將實驗動物安樂死并取得股骨下段標本,肉眼觀察研究各組標本的大體形態(tài),以Micro-CT檢測各組標本微觀結(jié)構(gòu)和興趣區(qū)域的骨參數(shù)變化情況,以硬組織切片和甲苯胺藍染色、HE染色觀察各組標本的組織形態(tài)學特征。結(jié)果:術(shù)后所有實驗動物均存活,無特殊不良并發(fā)癥發(fā)生。肉眼觀見eLTPS和對照組在12周時都獲得骨性愈合。Micro-CT結(jié)果顯示eLTPS組材料周圍骨小梁數(shù)量更多,排列形態(tài)相對更好。eLTPS組標本的關(guān)鍵骨參數(shù)獲得了一定程度的改善,優(yōu)于對照組。組織形態(tài)學結(jié)果顯示材料生長情況良好,周圍未見明顯的炎性組織反應(yīng)。相對與對照組,eLTPS組材料周圍新骨組織長入明顯更多,周圍骨小梁數(shù)量更多,結(jié)構(gòu)和排列良好,材料內(nèi)部也有更多的新骨組織長入替代原材料和血管生成。結(jié)論:在兔骨質(zhì)疏松骨缺損動物模型中,eLTPS組和對照組獲得了不同程度的骨修復愈合結(jié)果。eLTPS組獲得了更好的骨組織微觀結(jié)構(gòu)和良好的骨參數(shù)改善。組織形態(tài)學結(jié)果進一步驗證eLTPS組有更理想的局部新生骨長入能力。綜上所述,可以認為eLTPS對骨質(zhì)疏松缺損修復的具有促進作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R580;R687

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本文編號：1649067