發(fā)布時(shí)間：2018-03-21 10:18

  本文選題：創(chuàng)面愈合　切入點(diǎn)：LED紅光　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:創(chuàng)面愈合整個(gè)過程是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,創(chuàng)面因?yàn)榫植客鈧蛘卟∽兪沟闷つw完整性遭受破壞而形成的損傷。初期,創(chuàng)面內(nèi)不同的信號(hào)通路就已經(jīng)激活,便進(jìn)入創(chuàng)面愈合的生理步驟。一般分為四個(gè)不同的時(shí)期:出血期,炎癥期,增殖期以及重塑期。不同的時(shí)期包含各種不同的影響因素。創(chuàng)面愈合開始后,創(chuàng)周成纖維細(xì)胞增殖并合成分泌膠原為角質(zhì)形成細(xì)胞移行鋪平道路,而角質(zhì)形成細(xì)胞先是通過解離細(xì)胞間以及細(xì)胞和基質(zhì)之間的粘附和連接,細(xì)胞肌動(dòng)蛋白微絲重排等來驅(qū)使細(xì)胞不斷地向創(chuàng)面中心移動(dòng)。而這過程受生長因子,細(xì)胞因子,趨化因子,抗菌肽,氧分壓以及金屬蛋白酶基質(zhì)等諸多因素的影響。當(dāng)然創(chuàng)面愈合是個(gè)多步驟,由多種細(xì)胞共同完成的過程,創(chuàng)面再上皮化(re-epithelialization)作為其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在表皮屏障的完整性恢復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。HIF-1α是一種十分重要的轉(zhuǎn)錄因子,一般認(rèn)為在低氧條件下被調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,參與細(xì)胞的各種代謝及其他生物學(xué)功能。HIF-1α參與調(diào)控60多種基因,并調(diào)控細(xì)胞的增殖以及移行,而細(xì)胞的增殖移行在創(chuàng)面愈合中也發(fā)揮重要作用。HIF-1α表達(dá)升高可以明顯改善糖尿病的創(chuàng)面愈合。有文獻(xiàn)報(bào)道抑制HIF-1α表達(dá)可以明顯使得成纖維細(xì)胞移行減慢,而上調(diào)HIF-1α表達(dá)則可以明顯加快成纖維細(xì)胞移行。在人的角質(zhì)形成細(xì)胞中,HIF-1α可以提高細(xì)胞的移行,但是具體機(jī)制仍然不是很清楚。因此,研究HIF-1α對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞移行調(diào)控十分重要。目前,臨床上有很多方法用來治療創(chuàng)面愈合。包含生長因子的使用,負(fù)壓吸引,敷料包扎。最近,還出現(xiàn)了一些物理療法,比如電場(chǎng),磁場(chǎng)的應(yīng)用。而進(jìn)年來光療在創(chuàng)面上應(yīng)用也得到了極大普及和發(fā)展。而且被證明是十分有效的手段。低能量的激光可以很好的改善創(chuàng)面愈合。這一結(jié)論已被很多實(shí)驗(yàn)證實(shí),而LED燈光和激光也有著同樣的效果。本文主要介紹紅光(640nm)對(duì)創(chuàng)面角質(zhì)形成細(xì)胞移行的影響。雖然很多報(bào)道光照可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合,但是較少報(bào)道具體闡述其分子機(jī)制,因此,本文闡述了紅光對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞移行的影響,以及其分子HIF-1α表達(dá)變化。光照確實(shí)可以改變細(xì)胞的骨架形態(tài),在He La細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)升高后細(xì)胞骨架得到改變。所以我們假設(shè)在角質(zhì)形成細(xì)胞中,光照是否一樣可以通過改變角質(zhì)形成細(xì)胞的骨架形態(tài)進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的移行。本文通過上調(diào)以及降低角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)觀察角質(zhì)形成細(xì)胞骨架的變化,并同時(shí)探討了紅光在阻斷HIF-1α下對(duì)細(xì)胞骨架的影響。從而分析紅光對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞移行的具體分子機(jī)制。研究方法:1.利用人術(shù)后包皮組織提取分離原代角質(zhì)形成細(xì)胞,應(yīng)用紅光照射后在活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)拍攝技術(shù)下觀察單個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性,并使用Image J軟件進(jìn)行分析,同時(shí)使用人皮膚角質(zhì)化細(xì)胞片層劃痕制作體外細(xì)胞創(chuàng)面愈合模型。觀察劃痕后單層細(xì)胞創(chuàng)面愈合面積的變化來觀察640nm紅光對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響。同時(shí)應(yīng)用CCK-8檢測(cè)紅光對(duì)細(xì)胞增殖的影響。2.同上述方法紅光照射后,然后運(yùn)用WB法檢測(cè)光照后的人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)變化。同時(shí)應(yīng)用鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察光照對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞在光照后骨架的改變。用Image J軟件分析骨架改變情況。3.培養(yǎng)分離人角質(zhì)形成細(xì)胞后,分別單純應(yīng)用DMOG和COCL2處理角質(zhì)形成細(xì)胞以上調(diào)其HIF-1α的表達(dá)來觀察細(xì)胞骨架的改變,并用WB方法驗(yàn)證上調(diào)后蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞骨架的免疫染色同上述方法。4.YC-1是HIF-1α特異性阻斷劑,在同上述光照及分組方法,在光照下應(yīng)用YC-1阻斷HIF-1α的表達(dá)來觀察人原代角質(zhì)形成細(xì)胞骨架的改變。結(jié)果:1.LED光照促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和移行。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,LED紅光(12 J/cm2 and 24 J/cm2)與對(duì)照組相比,單個(gè)角質(zhì)形成細(xì)胞在活細(xì)胞工作站觀察下運(yùn)動(dòng)性增加,其中12 J/cm2更為明顯,所以在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,主要選擇的紅光能量也是12 J/cm2。在此能量下,角質(zhì)形成細(xì)胞移行也更為顯著。應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖,提示光照組和對(duì)照組沒有明顯差異。2.LED光源增加角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞骨架重排通過分析紅光照射3,6,12小時(shí)后HIF-1α的表達(dá)情況,可以發(fā)現(xiàn)紅光照射可以明顯上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá),同時(shí)紅光照射組細(xì)胞形態(tài)也展開明顯,通過鬼筆環(huán)肽熒光染色也可以發(fā)現(xiàn)F-actin表達(dá)非常明顯。3.HIF-1α激動(dòng)劑氯化鈷和DMOG可明顯促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞F-actin的表達(dá)通過WB方法證明分別單獨(dú)可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá),同時(shí)Co Cl2(100μM、200μM)和DMOG(0.5 m M、1 m M)處理的細(xì)胞骨架也明顯改變,熒光染色的細(xì)胞F-actin表達(dá)也更為強(qiáng)烈。4.HIF-1α特異性抑制劑YC-1可以通過阻斷HIF-1α抑制光照對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。YC-1是特異性HIF-1α阻斷劑,通過WB方法檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組(光照與非光照同時(shí)添加YC-1 0,20和50μM)證實(shí)YC-1可阻斷紅光上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的作用。同時(shí),通過熒光染色細(xì)胞骨架比較不同實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn),YC-1可以通過降低HIF-1α的表達(dá)抑制光照對(duì)細(xì)胞骨架表達(dá)的積極作用。結(jié)論本章節(jié)研究發(fā)現(xiàn)LED紅光(640nm)明顯提高人角質(zhì)形成細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性以及細(xì)胞移行,但對(duì)細(xì)胞增殖沒有促進(jìn)作用。LED光能明顯上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞HIF-1α的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞F-actin的表達(dá),而此與細(xì)胞的移行密切相關(guān)。單純的HIF-1α促進(jìn)劑處理角質(zhì)形成細(xì)胞后也可以促進(jìn)細(xì)胞F-actin的表達(dá),而YC-1可以抑制HIF-1α的表達(dá),同時(shí)抑制了紅光對(duì)細(xì)胞骨架表達(dá)的積極作用。所以我們可以得出LED紅光是通過HIF-1α改變細(xì)胞骨架,從而調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞移行,進(jìn)一步影響再上皮化和創(chuàng)面愈合的過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R64

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