本文選題：腎癌　切入點(diǎn)：NPRL2　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腎癌發(fā)源于泌尿小管上皮,是成人中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。早期可以手術(shù)切除,但術(shù)后一部分患者仍然發(fā)生轉(zhuǎn)移,晚期則失去手術(shù)根治機(jī)會(huì),并且缺乏特效治療方法。雖然細(xì)胞因子及分子靶向藥物等對(duì)腎癌有一定的療效,但總體效果均不夠理想。而惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因的功能改變密切相關(guān),因此探索基因療法具有積極意義,也是腎癌治療的長(zhǎng)期研究熱點(diǎn)。NPRL2(nitrogen permease regulator-like 2)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)與熱點(diǎn)研究的抑癌基因之一,與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切。課題組前期發(fā)現(xiàn)NPRL2在腎癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織明顯下降,轉(zhuǎn)染外源性NPRL2基因?qū)δI癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用,提示NPRL2在腎癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色。但利用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)肽[瘤宿主細(xì)胞,存在轉(zhuǎn)染效率低、基因突變及丟失等一系列問(wèn)題,而新的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽CTP可高效攜帶蛋白質(zhì)穿透胞膜并專性定位于胞漿,提供了解決問(wèn)題的可能性。在基因治療研究中,應(yīng)用的載體系統(tǒng)主要有病毒和非病毒(脂質(zhì)體等)兩大類,前者存在病毒滴度低、缺乏安全性與引起突變等缺點(diǎn),后者也存在缺乏腫瘤靶向性、轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn),而雙歧桿菌為腸道重要的厭氧益生菌,對(duì)腫瘤低氧區(qū)具有特異靶向性,是一種良好的腫瘤基因治療靶向載體。本課題在前期基礎(chǔ)之上對(duì)抑癌基因NPRL2進(jìn)行深一步的研究,利用CTP顯著的胞漿定位與高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)潛能,率先提出了“通過(guò)NPRL2與CTP融合表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)外源性NPRL2蛋白?內(nèi)源化?”的策略。通過(guò)原核表達(dá)CTP-NPRL2融合蛋白,利用CTP的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能將NPRL2蛋白轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞后觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變,同時(shí)以雙歧桿菌為載體在裸鼠腎癌模型上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)估療效,最終運(yùn)用基因芯片、蛋白質(zhì)譜等技術(shù)初步揭示雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制,以期為腎癌尋找到一種新的基因治療方法。本論文總共分兩部分。第一部分CTP轉(zhuǎn)導(dǎo)NPRL2蛋白對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O生物學(xué)行為的影響目的:證實(shí)CTP能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)NPRL2蛋白進(jìn)入人腎癌細(xì)胞786-O并對(duì)該細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。方法:1.構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2并分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并Western blot驗(yàn)證。2.FITC分別標(biāo)記CTP-NPRL2和NPRL2兩種蛋白,激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白在細(xì)胞中的定位,FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。3.根據(jù)作用蛋白的不同將實(shí)驗(yàn)分為CTP-NPRL2組、NPRL2組及空白對(duì)照組,每組均處理786-O,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖,FACS檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡,Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲及遷移能力。結(jié)果:1.重組質(zhì)粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)Western blot驗(yàn)證能夠表達(dá)出目的蛋白。2.激光共聚焦顯微鏡顯示CTP-NPRL2組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光并顯著定位于胞漿,而NPRL2組及空白對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光。FACS顯示CTP-NPRL2融合蛋白以75%左右的高效率轉(zhuǎn)入腎癌細(xì)胞786-O,而NPRL2蛋白幾乎不能進(jìn)入該細(xì)胞。3.與NPRL2組及空白對(duì)照組相比,CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CTP-NPRL2組細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P0.05),FACS顯示CTP-NPRL2組的凋亡率顯著增高(P0.01)且處于G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P0.05),Transwell顯示CTP-NPRL2組細(xì)胞侵襲及遷移能力明顯降低(P0.01)。同時(shí)CTP-NPRL2融合蛋白隨其濃度增加而作用增強(qiáng)。NPRL2組與空白對(duì)照組以上比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:CTP能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)NRPL2蛋白進(jìn)入腎癌細(xì)胞786-O并對(duì)該細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤抑制作用,并且隨CTP-NPRL2融合蛋白濃度增加而作用增強(qiáng)。第二部分雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的療效及機(jī)制研究目的:探討雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌模型的療效,并利用基因芯片與蛋白質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果綜合分析的策略探索相應(yīng)的分子機(jī)制,以期從整體水平上揭示該治療方法的作用原理,并篩選出關(guān)鍵性的靶基因。方法:1.786-O細(xì)胞懸液皮下注射法構(gòu)建裸鼠腎癌模型,通過(guò)病理切片證實(shí)模型是否構(gòu)建成功。2.厭氧法培養(yǎng)嬰兒雙歧桿菌,電轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒p ET15b-CTPNPRL2、p ET15b-NPRL2及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)雙歧桿菌,Western blot驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。3.將建模成功的裸鼠腎癌模型40只按處理因素不同隨機(jī)分為5組:雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組、雙歧桿菌+p ET15b-NPRL2組、雙歧桿菌+p ET15b組、雙歧桿菌組與生理鹽水組,每組8只,尾靜脈注射各菌液或生理鹽水,每周1次,共4次。4.通過(guò)觀察裸鼠重量、瘤體重量、雙腎重量及TUNEL檢測(cè)腫瘤組織凋亡情況以評(píng)估療效。5.基因芯片與蛋白質(zhì)譜檢測(cè)分別尋找經(jīng)雙歧桿菌介導(dǎo)CTPNPRL2處理后的裸鼠腎癌組織差異表達(dá)基因與蛋白,并進(jìn)行GO、Pathway、Pathway-network等生物信息學(xué)分析,結(jié)合閱讀文獻(xiàn),推斷雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制。6.篩選出可能的靶點(diǎn)基因,Real time-PCR、Western blot驗(yàn)證表達(dá)。7.選取代表性的靶基因,構(gòu)建3條針對(duì)該基因的干擾si RNA序列以及1條無(wú)義si RNA序列,Real time-PCR篩選最適干擾si RNA序列;構(gòu)建針對(duì)該基因的重組質(zhì)粒。8.探討代表性靶基因?qū)?86-O生物學(xué)行為的影響,將實(shí)驗(yàn)分為干擾si RNA組、無(wú)義si RNA組、空白對(duì)照組、重組質(zhì)粒組與空質(zhì)粒組,處理786-O細(xì)胞,Real time-PCR和Western Blot檢測(cè)每組代表性基因的表達(dá),CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖,FACS檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡。結(jié)果:1.裸鼠皮下生長(zhǎng)出腫塊并經(jīng)病理切片證實(shí)為腎癌。2.電轉(zhuǎn)重組質(zhì)粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2及空質(zhì)粒后雙歧桿菌能夠良好生長(zhǎng),經(jīng)Western blot驗(yàn)證表達(dá)出目的蛋白。3.雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組裸鼠重量明顯改善,瘤體重量減輕,與其余任意一組相比具有顯著差異(均P0.01),而剩余各組之間無(wú)明顯差異(均P0.05),雙腎重量在各組間亦無(wú)明顯差異(均P0.05)。雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組凋亡率(26.8±4.15)%與生理鹽水組凋亡率(11.6±3.58)%有顯著差異(P0.01)。4.基因芯片篩選出雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織差異表達(dá)2倍以上基因565個(gè),其中313個(gè)在雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組表達(dá)上調(diào),252個(gè)表達(dá)下調(diào);GO分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有:細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞遷移的調(diào)控等;Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有:細(xì)胞外基質(zhì)組建、G0/G1早期、整合素介導(dǎo)的細(xì)胞表面相互粘附、細(xì)胞周期等;Pathway-network分析處于中心地位的Term為:MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞周期。5.蛋白質(zhì)譜篩選出雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組與生理鹽水組腎癌組織表達(dá)差異1.5倍以上蛋白560個(gè),其中79個(gè)在雙歧桿菌+p ET15b-CTP-NPRL2組表達(dá)上調(diào),481個(gè)表達(dá)下調(diào);GO分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有:細(xì)胞外膜泡小體、Rac信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯起始、細(xì)胞外基質(zhì)成分等;Pathway分析顯著富集的Term中與腫瘤相關(guān)的有:β1整合素細(xì)胞表面相互作用、Ras通路、C-MYB轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)、膠原降解等;Pathway-network分析處于中心地位的Term為:MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。6.選取出四個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因:ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2。Real time-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示雙歧桿菌+p ET15bCTP-NPRL2組ANXA1表達(dá)增高約1.86倍,而TIAL1、PRMT1、ANGPTL2基因表達(dá)分別下降約1.77、2.24、19.56倍;Western blot驗(yàn)證結(jié)果基本一致。7.選取出差異倍數(shù)最大的ANGPTL2進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)功能驗(yàn)證,CCK-8顯示重組質(zhì)粒組細(xì)胞增殖明顯增加,干擾si RNA組細(xì)胞增殖明顯減少。8.FACS顯示各組細(xì)胞凋亡率分別是(10.06±0.27)%、(2.93±0.30)%、(2.99±0.11)%、(1.98±0.11)%、(3.13±0.08)%。重組質(zhì)粒組與其余任意一組相比有顯著性差異(均P0.01),同理干擾si RNA組;而其余三組任意兩組相比無(wú)顯著性差異(均P0.05)。各組處于G0/G1期的細(xì)胞比例分別是(69.32±2.45)%、(54.89±0.48)%、(54.22±2.7)%、(46.57±0.13)%、(56.05±4.29)%。重組質(zhì)粒組與其余任意一組相比有顯著性差異(均P0.01),同理干擾si RNA組;而其余三組任意兩組相比無(wú)顯著性差異(均P0.05)。結(jié)論:1.雙歧桿菌-CTP-NPRL2能夠抑制裸鼠腎癌的生長(zhǎng),增加腎癌組織的凋亡并改善裸鼠體重。2.雙歧桿菌-CTP-NPRL2調(diào)節(jié)了包括ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2在內(nèi)的一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因的表達(dá),這些基因涉及癌基因、抑癌基因、增殖與凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、血管生長(zhǎng)基因等。3.ANGPTL2具有癌基因功能,過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞786-O的增殖、減少凋亡,而抑制表達(dá)則降低該細(xì)胞的增殖、增加凋亡;同時(shí)抑制ANGPTL2表達(dá)能阻滯腎癌細(xì)胞786-O細(xì)胞周期于G0/G1期,反之則結(jié)果相反。4.在雙歧桿菌-CTP-NPRL2調(diào)節(jié)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因中,對(duì)ANGPTL2基因表達(dá)的抑制發(fā)揮了重要作用。5.雙歧桿菌-CTP-NPRL2可能主要通過(guò)MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)裸鼠腎癌的抑制功能。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.11

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1 曾洋;雙歧桿菌介導(dǎo)CTP-NPRL2治療裸鼠腎癌的分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1625167