發(fā)布時間：2018-03-13 19:08

  本文選題：腎母細胞瘤　切入點：系統(tǒng)評價　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:腎母細胞瘤(Wilms'tumor,WT)是兒童泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤,發(fā)病高峰年齡為1-3歲,約有5%的患兒雙側(cè)腎臟受累,年發(fā)病率為1/10000。大多數(shù)患兒為散發(fā)病例,大約有10%WT病例伴發(fā)生殖細胞突變和(或)先天性發(fā)育畸形,比如Beckwith-Wiedemann、Denys-Drash、Perlman和WAGR等綜合征。WT是起源于原始后腎胚基的惡性混合性腫瘤,主要包含上皮、間質(zhì)和胚芽等成分,除了以上三種典型成分外,WT中也可能包含軟骨、骨樣組織及神經(jīng)組織等成分,這些異質(zhì)性成分提示W(wǎng)T病因的復雜性并激發(fā)科研人員數(shù)十年的積極探索。WT1作為WT第一個抑癌基因,于1990首次被克隆。隨后,CTNNB1、WTX等基因突變相繼被發(fā)現(xiàn)并克隆。WT1、CTNNB1和WTX基因突變約占到總病例數(shù)的1/3。同時,WT的發(fā)生發(fā)展還與其他許多基因改變有關,比如p53、MYCN、CITED1、SIX2、TOP2A及CRABP2等。尤其是在間變型WT中發(fā)現(xiàn)有75%存在p53基因突變,提示該基因突變是組織不良型WT的不良預后標志物,可能與WT進展、復發(fā)及轉(zhuǎn)移有密切關系。近年來,相繼有多個研究團隊報道發(fā)現(xiàn)WT中與小RNA相關基因突變(如DROSHA和DGCR8),約15%WT的樣本中被檢測出。與MYCN基因突變一樣,DROSHA和DGCR8等基因突變也只是小眾突變基因,還有大量wt的驅(qū)動基因的突變尚未明確。目前已有大量拷貝數(shù)改變及雜合性丟失(loh)等相關病例報道,其中一些改變?nèi)?1ploh和17p拷貝數(shù)減少已明確影響相關基因,但其他位點如1q拷貝數(shù)增加、1p拷貝數(shù)減少及16q拷貝數(shù)減少等尚不能確認與具體基因相關。maw等于1992年首次報道了16qloh變異頻率,并證實部分伴發(fā)1ploh。隨后nwts-3和nwts-4的兩項研究結果表明,1p和(或)16qloh與不良預后存在正相關性,并建議該類患兒需要強化化療。因此,探討wt的病因,尋找wt的分子生物學標志物,對兒童wt的診斷、治療及預后具有重大的價值。過去數(shù)十年,已有大量wt相關基因突變頻率被報道,但結果常常差異較大,究其原因可能與研究樣本量、種族差異及測序方法各異等因素有關。為了克服單個研究的局限性,本課題首先采用系統(tǒng)評價方式,全面闡述與wt相關基因的功能和生物學意義。隨后采用新一代測序技術,對wt與癌旁正常組織全轉(zhuǎn)錄組高通量測序,篩選相關差異表達基因并進行功能驗證。本文的主要研究內(nèi)容及結果如下:第一部分:wt相關基因變異頻率的系統(tǒng)評價目的:基于系統(tǒng)評價,全面分析wt相關基因變異頻率及意義。方法:計算機檢索pubmeb、ovid、embase和cochranelibrary等數(shù)據(jù)庫,檢索時限截至2015年9月。由2名研究員按照納入與排除標準獨立篩查文獻、提取信息和評價質(zhì)量后,應用stata12.0軟件進行系統(tǒng)評價。結果:1.wt1、wtx和ctnnb1基因總變異約占總病例數(shù)的1/3。2.p53的突變與組織不良型wt有關。3.mycn在wt的發(fā)生率并不高,它可能不是wt的驅(qū)動基因缺陷。4.drosha、dgcr8等基因改變可能與wt病因有關,但仍需更多大樣本實驗證實。5.loh在wt病因診斷中敏感性較低,需要結合其他生物學標記分析。第二部分:wt全轉(zhuǎn)錄組測序分析目的:構建wtcdna文庫,篩選差異表達基因。方法:1.采用高通量深度測序分析法,對wt組織及癌旁正常組織進行全轉(zhuǎn)錄組測序。2.q-pcr驗證差異表達基因。結果:1.成功構建cdna文庫。2.篩選出差異表達候選基因有asic1、scg5、hnrnpl和cacnb4等。3.q-pcr驗證asic1、scg5、hnrnpl及cacnb4等差異表達基因與測序結果基本一致。第三部分:hnrnpl在wt增殖、凋亡中的調(diào)控作用及機制研究目的:探討hnrnpl在wt增殖、凋亡中的調(diào)控作用及機制研究。方法:1.利用rna免疫共沉淀方法探討hnrnpl蛋白與p53mrna之間的關系。2.構建sirnahnrnpl表達載體,體外轉(zhuǎn)染g401細胞株,mtt法分析g401細胞生長變化,流式細胞術檢測細胞調(diào)亡情況。體內(nèi)裸鼠實驗,觀察腫瘤生長情況。3.q-pcr和westernblot檢測hnrnpl基因被抑制后g401細胞hnrnpl、p53和bcl2mrna和蛋白質(zhì)的表達。結果:1.rna免疫共沉淀實驗證實hnrnpl能與p53的mrna特異性的結合。2.沉默hnrnpl基因后,g401細胞體內(nèi)外生長抑制、細胞凋亡加速。3.沉默hnrnpl基因后,hnrnpl、p53和bcl2mrna和蛋白質(zhì)的表達下調(diào)。結論:與wt相關的基因改變包括:wt1、wtx、ctnnb1、p53、mycn、drosha、dgcr8等基因,以及多個位點的拷貝數(shù)改變及雜合性丟失等。但以上改變頻率并不高,目前還有大量驅(qū)動基因尚未確認,需要以后進行基因測序研究探明。通過轉(zhuǎn)錄組測序成功構建cDNA文庫,篩選出差異表達候選基因有ASIC1、SCG5、hnRNPL和CACNB4等。發(fā)現(xiàn)hnRNPL在WT中表達上調(diào),并能與p53的mRNA特異性的結合。沉默hnRNPL基因后,hnRNPL、p53和Bcl2的mRNA及蛋白表達下調(diào),G401細胞體內(nèi)外生長抑制、細胞凋亡加速。hnRNPL可能通過p53/Bcl2信號通路參與WT的增殖與凋亡。
[Abstract]:Background: nephroblastoma (Wilms'tumor, WT) is the most common malignant tumor of urinary system in children, the peak age of onset was 1-3 years old, about 5% of children with bilateral renal involvement, the annual incidence rate of 1/10000. in most cases are sporadic cases, about 10%WT of the patients with germ cell mutation and (or) congenital of malformations, such as Beckwith-Wiedemann, Denys-Drash, Perlman and WAGR.WT syndrome is a malignant mixed tumor originated from primitive metanephric blastema, including epithelial, stromal and germ and other ingredients, in addition to the above three kinds of typical components, including cartilage may WT, osteoid tissue and nerve tissue components the complexity of these heterogeneous elements, suggesting that the etiology of WT and stimulate researchers for decades and actively explore.WT1 as the first WT tumor suppressor gene, was cloned for the first time in 1990. Subsequently, CTNNB1, WTX gene mutations have been found and Cloning of.WT1, CTNNB1 and WTX mutations account for about 1/3. of the total number of cases at the same time, the development of WT and many other related genes, such as p53, MYCN, CITED1, SIX2, TOP2A and CRABP2. Especially in anaplastic WT found 75% mutations of p53, suggesting that the gene mutation is poor prognosis of adverse tissue type WT markers, and WT may progress, there is a close relationship between recurrence and metastasis. In recent years, there have been many research teams reported associated with small RNA gene mutations in WT (such as DROSHA and DGCR8), about 15%WT in the samples were detected. MYCN gene mutation, DROSHA and DGCR8 gene mutation are niche mutation and gene mutation driven a large number of WT is not yet clear. There are a large number of copy number changes and loss of heterozygosity (LOH) and other related reports, including some changes such as 11ploh and 17p copy number has clearly reduced Effect of related genes, but other sites such as 1q copy number increase, the copy number of 1p and 16q reduce the reduction in the number of copies is not confirmed with specific genes related to.Maw in 1992 was reported for the first time 16qloh mutation frequency, and confirmed that part with 1ploh. followed by nwts-3 and nwts-4 of the two study results indicate that 1p and (or) 16qloh there is a positive correlation with poor prognosis, and suggested that these patients need intensive chemotherapy. Therefore, to explore the causes of WT, finding the molecular markers of WT, diagnosis of WT in children, with great value of treatment and prognosis. Over the past few decades, there has been a large number of WT related gene mutation frequency was reported, but the results are often quite different may, the reason and research sample, about racial differences and different factors such as sequencing method. In order to overcome the limitations of individual studies, this paper adopts the system evaluation methods, a comprehensive exposition of wt base The function and biological significance. Then by using a new generation of sequencing technology, WT tissues and normal whole transcriptome high-throughput sequencing, screening of differentially expressed genes and functional verification. The main research contents and results of this paper are as follows: the first part: a systematic review of WT related gene mutation frequency Objective: Based on the evaluation system comprehensive analysis, frequency and significance of WT gene mutation. Methods: We searched pubmeb, Ovid, EMBASE and cochranelibrary databases were searched by the end of September 2015. By 2, according to the inclusion and exclusion criteria independent screening literature, information extraction and quality evaluation, evaluate the application of stata12.0 software. Results: 1.wt1 and WTX. CTNNB1 gene mutation and total variation accounted for about.3.mycn in adverse tissue type wt wt incidence rate is not high the total number of cases of 1/3.2.p53, it may not drive gene wt The defect of.4.drosha, dgcr8 gene may be related to the etiology of WT, but it still needs more large sample tests showed that.5.loh sensitivity in WT diagnosis is low, need to be combined with other biological markers. The second part: WT whole transcriptome sequencing analysis objective: to construct a wtcdna Library of differentially expressed genes. Methods: 1. using high throughput deep sequencing analysis, gene expression of whole transcriptome sequencing.2.q-pcr verification on WT of different tissues and adjacent normal tissues. Results: 1. successfully constructed cDNA.2. library screened differentially expressed candidate genes ASIC1, scg5, hnrnpl and cacnb4.3.q-pcr scg5, hnrnpl ASIC1 verification and cacnb4 of differentially expressed genes and sequencing results consistent. The third part: hnrnpl in WT proliferation, apoptosis objective to study the regulatory role and mechanism of hnrnpl in WT: To investigate the effect and mechanism of proliferation, regulation of apoptosis. Methods: 1. using RN A co immunoprecipitation method to study the relationship between the.2. protein and hnrnpl p53mrna to construct sirnahnrnpl expression vector, transfected g401 cell line, analysis of the growth changes of g401 cell MTT assay, flow cytometry to detect the apoptosis of g401 cells in nude mice. In vivo, hnrnpl detection of hnrnpl gene in tumor growth was observed with.3.q-pcr and Westernblot was inhibited. The expression of p53 and bcl2mrna and protein. Results: 1.rna co immunoprecipitation experiments confirmed that hnrnpl can bind to.2. hnrnpl gene silencing and p53 specific mRNA, g401 cells growth inhibition, apoptosis accelerated.3. hnrnpl gene silencing, hnrnpl, down regulate the expression of p53 and bcl2mrna and protein. Conclusion: WT the genetic changes include: WT1, WTX, CTNNB1, p53, MYCN, Drosha, dgcr8 genes, and the copy number changes of multiple sites and loss of heterozygosity. But the above change frequency is not high At present, there are a large number of driver genes has not been confirmed to be the study of gene sequencing proved by transcriptome sequencing. CDNA library was constructed and screened differentially expressed candidate genes ASIC1, SCG5, hnRNPL and CACNB4. It is found that the upregulation of the expression of hnRNPL in WT, and can be combined with p53 mRNA specific hnRNPL gene silencing. After hnRNPL, mRNA and protein expression of p53 and downregulation of Bcl2, G401 cells growth inhibition, cell apoptosis by.HnRNPL might accelerate the proliferation and apoptosis of p53/Bcl2 signaling pathway in WT.

【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.11

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李傳印,陳克時;老年腎母細胞瘤1例報告[J];第一軍醫(yī)大學學報;2000年04期

2 丁瑩瑩,高德培,譚驊;成人腎母細胞瘤一例[J];臨床放射學雜志;2000年12期

3 郭心杰,馮全森,馬法仲;成人腎母細胞瘤1例[J];菏澤醫(yī)專學報;2000年02期

4 張福丙,王孝廉,賈守道,穆春來,郭海峰,王力;巨大成人腎外腎母細胞瘤2例[J];臨床泌尿外科雜志;2000年07期

5 龍德云,陳明安,陳和平;原發(fā)性腎母細胞瘤轉(zhuǎn)移肺內(nèi)1例[J];中國臨床醫(yī)學影像雜志;2000年S1期

6 陳登永,王勇;腎母細胞瘤1例[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志;2000年08期

7 李文杰,劉和平;成人腎母細胞瘤1例[J];中國醫(yī)學影像技術;2000年09期

8 譚秋,李梅;腎母細胞瘤8例誤診分析[J];臨床醫(yī)學;2000年05期

9 劉成文,李平,婁彥艷,李甘地;成人腎母細胞瘤1例報告[J];華西醫(yī)科大學學報;2001年01期

10 王洪燕,焦順昌,林雁,王秀芹;成人腎母細胞瘤3例[J];中國腫瘤臨床;2001年09期

相關會議論文 前10條

1 劉志剛;耿玲玲;束玉萍;吳紅艷;何敏;;小兒腎母細胞瘤30例臨床診療分析[A];第八屆全國兒童腫瘤學術會議論文匯編[C];2009年

2 王勇;王兆陽;閆軍美;;小兒腎母細胞瘤的綜合治療(附20例報告)[A];第八屆全國兒童腫瘤學術會議論文匯編[C];2009年

3 翟欽;柴憶歡;周云;嚴向明;;腎母細胞瘤18例臨床分析[A];第六屆江浙滬兒科學術會議暨兒科學基礎與臨床研究進展學術班論文匯編[C];2009年

4 陸鵬;何大維;林濤;李旭良;魏光輝;劉俊宏;;小兒腎母細胞瘤術后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的臨床診療分析[A];中華醫(yī)學會第八次全國小兒外科學術會論文集[C];2010年

5 宋宏程;黃澄如;白繼武;孫寧;張濰平;田軍;謝向輝;李明磊;李寧;;腎母細胞瘤病(附5例病例分析)[A];中華醫(yī)學會第八次全國小兒外科學術會論文集[C];2010年

6 張小安;;腎母細胞瘤螺旋CT征象與血管內(nèi)皮生長因子表達間關系的研究[A];中華醫(yī)學會第十三屆全國放射學大會論文匯編（下冊）[C];2006年

7 張應權;安妮妮;何國慶;唐應明;唐仕忠;范霞;劉迪;;小兒腎母細胞瘤的手術治療[A];中國抗癌協(xié)會第七屆全國小兒腫瘤學術會議論文匯編[C];2007年

8 壽建忠;李瑞乾;肖振東;肖澤均;田軍;王棟;畢新剛;管考鵬;魯力;韓蘇軍;石泓哲;趙欣;關有彥;馬建輝;李長嶺;;成人腎母細胞瘤的臨床分析[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

9 倪雙雙;吳道珠;林益怡;;小兒腎母細胞瘤的超聲診斷價值[A];2008年浙江省超聲醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2008年

10 盛琦;張勤;袁曉軍;吳貽明;蔣馬偉;李玉華;;兒童晚期腎母細胞瘤的治療[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術大會論文匯編（下冊）[C];2012年

相關重要報紙文章 前9條

1 ;小兒腎母細胞瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達及臨床意義[N];中國醫(yī)藥報;2003年

2 陳錦屏 常保東 宋海霞;切除巨大腎母細胞瘤[N];健康報;2006年

3 天津腫瘤醫(yī)院兒童腫瘤科 閆杰;洗澡時多摸摸孩子肚子[N];健康時報;2008年

4 段文利 黃鐘明 郭毅;巨大腎母細胞瘤被切除[N];科技日報;2006年

5 段文利 黃鐘明 郭毅;北京協(xié)和醫(yī)院成功切除成人巨大腎母細胞瘤[N];中國醫(yī)藥報;2006年

6 謝欣;幼女何以懷“怪胎”[N];大眾衛(wèi)生報;2000年

7 劉永平邋岳麗穎;兒童腹部包塊要當心[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

8 葛秋芳;英國最新研究表明,干細胞療法可能引發(fā)癌癥[N];新華每日電訊;2007年

9 王炳輝;小兒癌癥如何治療[N];家庭醫(yī)生報;2006年

相關博士學位論文 前10條

1 張謙;蛋白質(zhì)組學技術在小兒腎母細胞瘤臨床中的應用研究[D];鄭州大學;2010年

2 王政;小兒腎母細胞瘤免疫治療的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2007年

3 賈煒;腎母細胞瘤中轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路差異表達基因的篩選、臨床意義及缺氧誘導因子1α介導侵襲性的機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

4 崔明宇;miR-21與PTEN靶向調(diào)控作用對腎母細胞瘤生物學行為的影響及作用機制的研究[D];山東大學;2017年

5 鄧常開;腎母細胞瘤異常表達基因的篩選及功能鑒定[D];重慶醫(yī)科大學;2017年

6 劉卓;miR-140-5p調(diào)控TGF-β和IGF-1信號通路影響腎母細胞瘤增殖和侵襲的分子機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2017年

7 李凱;腎母細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中端粒酶的表達和維生素A的影響[D];復旦大學;2003年

8 牛之彬;促血管生成因子及其部分相關因子在腎母細胞瘤中的表達及臨床意義的研究[D];中國醫(yī)科大學;2007年

9 賈占奎;腎母細胞瘤血清標記物的篩選與鑒定[D];鄭州大學;2012年

10 王磊;腎母細胞瘤血清非炎癥性標記物的篩選、鑒定及驗證[D];鄭州大學;2012年

相關碩士學位論文 前10條

1 盧海超;兒童復發(fā)性腎母細胞瘤臨床特點與治療的探討[D];廣西醫(yī)科大學;2011年

2 陳新讓;腎母細胞瘤血清蛋白質(zhì)標記物檢測與分期模型構建研究[D];鄭州大學;2007年

3 胡超;不同治療模式對小兒腎母細胞瘤預后的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2008年

4 邢欣然;腎母細胞瘤中ABCG2的表達[D];寧夏醫(yī)科大學;2015年

5 高雪翔;STAT3信號通路在腎母細胞瘤腫瘤干細胞發(fā)生發(fā)展及凋亡中的作用[D];蘭州大學;2016年

6 徐瑞;兒童腎母細胞瘤73例臨床分析與隨訪[D];山東大學;2016年

7 李峗頡;Par-4聯(lián)合順鉑對腎母細胞瘤抑制作用的實驗研究[D];南京醫(yī)科大學;2015年

8 田艷秋;擴增活化的自體淋巴細胞對裸鼠腎母細胞瘤移植瘤生長的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2017年

9 鄭娜;促血管生成素2在小兒腎母細胞瘤中的表達及與血管生成關系的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2009年

10 田俊嚴;腎母細胞瘤中血管內(nèi)皮生長因子和一氧化氮合酶表達與血管生成的關系及臨床意義[D];鄭州大學;2002年

，

本文編號：1607734