本文選題：miR-9　切入點(diǎn)：外泌體　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的:鼻咽癌是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,臨床以分化低、高轉(zhuǎn)移為主要特征,臨床上75%～90%的鼻咽癌病人初診時(shí)已是局部晚期并發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。盡管以調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)為主的放化療綜合治療使鼻咽癌的局控率有明顯提高,但目前臨床上仍無(wú)法對(duì)鼻咽癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期預(yù)測(cè)和有效干預(yù),其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和總體生存率并沒(méi)有顯著改觀,一旦復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移則預(yù)后較差,平均中位生存期只有7.3～10個(gè)月,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是病人死亡的主要原因。因此,全面解析鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,積極尋求切實(shí)有效且安全可靠的治療新途徑,是有效控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移從而提高患者生存率的關(guān)鍵。外泌體被證實(shí)能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與周圍組分進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物垂直傳遞來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成,促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此,外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到了非常重要的作用,可以是預(yù)測(cè)和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物和新治療靶點(diǎn)。腫瘤血管生成和血管通透性增加亦是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的特點(diǎn)之一,是促進(jìn)轉(zhuǎn)移的必要條件,亦被認(rèn)為是治療腫瘤和防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)。目前,已有腫瘤血管靶向藥物用于臨床并取得了鼓舞人心的臨床療效。但腫瘤的血管生成是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,且大多數(shù)腫瘤血管靶向治療藥物均針對(duì)非特異性地阻斷VEGF信號(hào)通路,導(dǎo)致產(chǎn)生血壓升高等副作用和藥物抵抗性。因此,還需要積極地去尋找全新的特異性更高的腫瘤血管治療靶點(diǎn),增強(qiáng)腫瘤血管靶向治療的效果。研究顯示microRNA在腫瘤血管生成機(jī)制中扮演著重要的角色,影響血管生成的miRNA被命名為angiomiR。angiomiR的發(fā)現(xiàn)為腫瘤血管靶向治療開(kāi)辟了新的領(lǐng)域,與既往單一靶點(diǎn)的抗血管生成藥物相比,如若能通過(guò)糾正angiomiR的表達(dá)異常達(dá)到抑制腫瘤血管生成的目的,則有可能避免藥物的副作用及藥物的抵抗性。腫瘤細(xì)胞被證實(shí)分泌microRNA由外泌體介導(dǎo)進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞影響腫瘤的血管生成。在本課題組前期的研究中,miR-9被證實(shí)參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移,但其表達(dá)異常是否能影響腫瘤血管生成繼而影響轉(zhuǎn)移,以及鼻咽癌細(xì)胞是否能分泌miR-9由外泌體運(yùn)載進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞從而影響血管生成等一系列問(wèn)題都不得而知。因此,為了明確miR-9表達(dá)失調(diào)對(duì)鼻咽癌血管生成的影響,證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞分泌的miR-9以外泌體介導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮功能,闡明分泌型miR-9對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響的分子機(jī)制和信號(hào)通路,我們進(jìn)行了相應(yīng)的研究。材料和方法:1、免疫組化和原位雜交:50例鼻咽癌組織石蠟標(biāo)本切片行CD31免疫組化與miR-9原位雜交;100例鼻咽癌組織和80例鼻咽炎組織石蠟標(biāo)本切片行MDK免疫組化。2、慢病毒包裝感染、exosome抽提及鑒定、示蹤實(shí)驗(yàn):慢病毒包裝感染構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-9、空載對(duì)照5-8F和CNE1細(xì)胞株;細(xì)胞上清液收集,差速離心法提取外泌體/Exoquick試劑提取外泌體;nanosight、western blot(CD63、TSG101)、電鏡驗(yàn)證外泌體;RNA提取,RT-qPCR檢測(cè)miR-9基因表達(dá);CY3標(biāo)記miR-9,PKH67標(biāo)記外泌體,激光共聚焦顯微鏡示蹤實(shí)驗(yàn)。3、體內(nèi)外功能試驗(yàn):CCK8、侵襲實(shí)驗(yàn)、成管實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)。4、靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證:Targetscan、Pictar、miRBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因,RT-qPCR對(duì)候選靶基因進(jìn)行篩選;針對(duì)篩選出來(lái)的靶基因MDK使用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及western blot進(jìn)行驗(yàn)證;磷酸化抗體芯片及western blot檢測(cè)信號(hào)通路PI3K/AKT和MAPK磷酸化蛋白水平5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料兩組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent-samples ttest)。采用Spearman法對(duì)免疫組化和原位雜交半定量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)采用析因方差分析(factorial design ANOVA)。多組等級(jí)資料的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),分類數(shù)據(jù)利用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。Kaplan-Meier法繪制生存曲線。生存期的多因素分析采用Cox回歸模型。結(jié)果1、鼻咽癌組織標(biāo)本中,Ⅲ～Ⅳ期miR-9表達(dá)顯著降低(Z=-3.635,P0.001),MVD 顯著升高(t=-3.507,P=0.001),miR-9 表達(dá)與 MVD 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3075,P=0.0298)。2、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-9鼻咽癌細(xì)胞株的建立及exosome的抽提和鑒定:穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-9的鼻咽癌細(xì)胞株5-8F Lv-miR-9中,miR-9表達(dá)量為對(duì)照組細(xì)胞的61.487倍(P=0.0016);CNE1 Lv-miR-9細(xì)胞株中miR-9的表達(dá)為對(duì)照組細(xì)胞的48.05倍(P=0.0048)。穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-9的鼻咽癌細(xì)胞株均可以分泌外泌體,與對(duì)照組相比,其外泌體的數(shù)量和形態(tài)相似,外泌體中miR-9的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)miR-9表達(dá)水平一致,過(guò)表達(dá)miR-9組5-8F Lv-miR-9外泌體中miR-9表達(dá)為對(duì)照組外泌體的36.56倍(P=0.0016);CNE1 Lv-miR-9外泌體中miR-9表達(dá)為對(duì)照組外泌體的24.77倍(P=0.0015)。激光共聚焦結(jié)果顯示鼻咽癌細(xì)胞分泌紅色熒光CY3標(biāo)記的miR-9由綠色熒光標(biāo)記的PKH67-外泌體運(yùn)載進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞3、體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn):CCK8結(jié)果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)增殖能力顯著降低(P0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖能力顯著降低(P0.001);侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs穿膜細(xì)胞數(shù)減少78.11%(P0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs穿膜細(xì)胞數(shù)減少63.51%(P0.001);成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對(duì)小管長(zhǎng)度縮短65.00%(P0.001),CNE1 Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對(duì)小管長(zhǎng)度縮短56.86%(P0.001);基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-9組膠栓內(nèi)新生血管顯著少于對(duì)照組膠栓,過(guò)表達(dá)miR-9組外泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對(duì)小管長(zhǎng)度縮短68.18%(P0.001)。4、靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證:靶基因篩選結(jié)果顯示在由生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的17個(gè)靶基因中,分泌型miR-9導(dǎo)致其中9個(gè)表達(dá)有差異,差異最顯著的為MDK(t=37.500,P=0.001);雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示分泌型miR-9能與MDK 3'UTR特異性結(jié)合影響熒光活性(t=33.924,P=0.000),但不能與MDK mt 3'UTR結(jié)合(t=0.975,P=0.385)。瞬轉(zhuǎn)miR-9 inhibitor,可以抑制分泌型miR-9與MDK 3'UTR結(jié)合,使熒光活性增強(qiáng)(t=26.077,P=0.001),對(duì)MDKmt3'UTR組熒光活性無(wú)影響(t=1.823,P=0.142);Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)miR-9的外泌體誘導(dǎo)的HUVECs中MDK蛋白表達(dá)水平顯著降低;抗體芯片結(jié)果顯示與與對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)miR-9的外泌體誘導(dǎo)的HUVECs在PI3K/AKT信號(hào)通路上出現(xiàn)七個(gè)蛋白磷酸化水平下降,其中差異最顯著的磷酸化蛋白P70S6k和PDK1在western blot上也得到了驗(yàn)證,而MAPK信號(hào)通路則未發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸化改變5、免疫組化結(jié)果顯示,慢性鼻咽炎鼻咽部上皮組織中MDK無(wú)表達(dá),鼻咽癌組織中MDK胞漿表達(dá);不同臨床分期的標(biāo)本中MDK表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),在100例鼻咽癌標(biāo)本中,相比于MDK低表達(dá)組而言,MDK高表達(dá)組中患者的T分期(P=0.001),N分期(P=0.005)和臨床分期(P=0.001)均明顯偏高;Kaplan-Meier生存分析顯示鼻咽癌患者中MDK高表達(dá)患者(OS:53.33個(gè)月,95%置信區(qū)間:45.56-61.11;PFS:50.02個(gè)月,95%可信區(qū)間:41.51-58.52個(gè)月)的預(yù)后要顯著差于MDK低表達(dá)患者(OS:78.13個(gè)月,95%置信區(qū)間:72.95-83.31個(gè)月;PFS:69.25個(gè)月,95%置信區(qū)間:62.81-75.69個(gè)月)。組間差異采用Log-rank檢驗(yàn)分析,結(jié)果分別為OS:Log-rank= 14.923,P=0.0001;PFS:Log-rank= 10.205,P=0.0014。總體生存時(shí)間的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的預(yù)后分析則顯示:MDK表達(dá)水平可作為鼻咽癌總體生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因素(RR=0.351,P=0.030)結(jié)論1、鼻咽癌組織標(biāo)本中miR-9表達(dá)強(qiáng)度與微血管密度呈負(fù)相關(guān)。2、鼻咽癌細(xì)胞分泌miR-9由外泌體介導(dǎo)進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞。3、鼻咽癌分泌型miR-9抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力。4、鼻咽癌分泌型miR-9抑制血管生成的機(jī)制為作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)靶基因MDK,從而抑制下游PI3K/AKT信號(hào)通路。5、鼻咽癌組織標(biāo)本中MDK的表達(dá)水平可作為鼻咽癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：1573964