本文選題：miR-454　切入點(diǎn)：結(jié)直腸癌　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景及意義結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見(jiàn)的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤,好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處,以40～50歲年齡組發(fā)病率最高,男女之比為2-3：1。結(jié)直腸癌是男性第三常見(jiàn)的腫瘤,女性第二常見(jiàn)的腫瘤。結(jié)直腸癌的癥狀和體征取決于腫瘤在腸道內(nèi)位置以及腫瘤在體內(nèi)擴(kuò)展的情況。早期結(jié)直腸癌診斷困難,因?yàn)槠錄](méi)有癥狀或癥狀不明顯,隨著腫瘤的進(jìn)展,其癥狀和體征逐漸出現(xiàn)。常見(jiàn)的報(bào)警癥狀有：頑固的便秘、大便潛血、大便變細(xì)、食欲不振及體重下降等等。當(dāng)50歲以上的人出現(xiàn)便血及貧血時(shí),更應(yīng)被列為高風(fēng)險(xiǎn)特征。結(jié)直腸癌主要分為三個(gè)類(lèi)型,分別為腺癌、黏液腺癌、未分化癌。腫瘤的形態(tài)大體呈息肉狀、潰瘍型等。結(jié)腸腫瘤可沿腸壁環(huán)行發(fā)展,沿腸管縱徑上下蔓延或向腸壁深層浸潤(rùn),除經(jīng)淋巴管、血流轉(zhuǎn)移和局部侵犯外,還可向腹腔內(nèi)種植或沿縫線(xiàn)、切口面擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。慢性結(jié)腸炎患者、結(jié)腸息肉患者、男性肥胖者等為易感人群。對(duì)可進(jìn)行手術(shù)的患者而言,手術(shù)是最常用的治療手段,其次是化學(xué)療法、放射療法、生物療法及中醫(yī)中藥等治療。然而,術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是非常常見(jiàn)的。因此,目前迫切需要找到結(jié)直腸癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)治療這種疾病的分子靶點(diǎn)。近期,真核生物內(nèi)生性的,非編碼的小RNA(19-22個(gè)核酸)microRNAs (miRNAs)被發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)與3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)的不完全雜交弱化甚至終止mRNA的翻譯。在幾種具有調(diào)控細(xì)胞增殖功能的miRNA中,miR-454被證實(shí)是數(shù)種癌癥的腫瘤細(xì)胞增殖的重要決定性因素。在此之后,有許多miR-454作用的靶基因被發(fā)現(xiàn)。在這些靶基因中,腫瘤抑制因子(CYLD)已被證實(shí)與癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。細(xì)胞增殖,作為腫瘤的最重要特征,是惡性腫瘤,尤其是結(jié)直腸癌的最主要致死因素。但到目前為止,結(jié)直腸癌與miR-454表達(dá)間的關(guān)系還未被闡明。在本研究中,我們報(bào)道了結(jié)直腸癌中miR-454與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。更多研究表明miR-454可以通過(guò)直接作用于CYLD基因的3'-UTR來(lái)抑制其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。由此我們做出推斷,以miR-454為分子靶點(diǎn)對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行治療,可能是針對(duì)結(jié)直腸癌新的、有效的治療方法。本研究分為五個(gè)部分進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)一研究目的：檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中miR-454的表達(dá)水平。研究方法：經(jīng)八位結(jié)直腸癌患者同意獲得其人結(jié)直腸癌組織以及相應(yīng)癌旁組織(TAT),用qRT-PCR評(píng)估檢測(cè)結(jié)直腸癌組織、癌旁組織的miR-454表達(dá)水平。另外,選用人類(lèi)CRC細(xì)胞株SW403, HT-29, COL0320DM, COL0205, SW480, KM202L, SW620和正常結(jié)腸細(xì)胞FHC,共八種細(xì)胞系,同樣用qRT-PCR評(píng)估檢測(cè)其miR-454表達(dá)水平。研究結(jié)果：從各qRT-PCR所得結(jié)果可以看到,與癌旁組織相比CRC組織中miR-454的表達(dá)水平明顯上調(diào),差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。并且所有7個(gè)測(cè)試的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的miR-454表達(dá)水平均高于正常結(jié)腸細(xì)胞系FHC。這些結(jié)果表明,可以認(rèn)為miR-454在結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí),這些結(jié)果表明,miR-454在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著增加,提示miR-454可作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標(biāo)。研究結(jié)論：miR-454在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著,說(shuō)明miR-454基因?qū)Y(jié)直腸癌發(fā)病有重要意義。實(shí)驗(yàn)二研究目的：研究miR-454基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用研究方法：以脂質(zhì)體為載體,將mir-454mimics,以及作為控制組的miR-454抑制基因miR-454 inhibitor (miR-454-in)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,并通過(guò)qRT-PCR評(píng)估轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞的miR-454水平,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功。使用兩種細(xì)胞進(jìn)行MTT、平板克隆形成,非錨定獨(dú)立生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),分析miR-454對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響。研究結(jié)果：MTT法的結(jié)果顯示,miR-454 mimics的轉(zhuǎn)染顯著增加了SW480細(xì)胞的增殖率,而集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。引人注目的是,我們發(fā)現(xiàn),miR-454的表達(dá)大大增強(qiáng)了SW480細(xì)胞的錨地獨(dú)立生長(zhǎng)能力。相反,轉(zhuǎn)染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480細(xì)胞的細(xì)胞增長(zhǎng)率和集落數(shù)與轉(zhuǎn)染了miR-454 mimics的SW480細(xì)胞相比顯著降低。此外,轉(zhuǎn)染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480細(xì)胞的錨地獨(dú)立生長(zhǎng)能力顯著下降。這些結(jié)果表明,在體外環(huán)境下,miR-454提高了結(jié)直腸癌細(xì)胞的致瘤性。研究結(jié)論：miR-454基因能夠顯著促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)三研究目的：研究miR-454對(duì)CYLD表達(dá)水平的影響研究方法：人們普遍認(rèn)為miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮它們的功能。利用生物信息學(xué)方法,我們預(yù)測(cè)了miR-454的潛在作用目標(biāo)：CYLD。這個(gè)含有一處miR-454結(jié)合部位的腫瘤抑制基因,被選定進(jìn)行進(jìn)一步的分析。為了確定miR-454是否影響了CYLD的表達(dá),我們選用miR-454 mimics, miR-454 inhibitor (miR-454-in)轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞和正常SW480細(xì)胞進(jìn)行CYLD表達(dá)的檢測(cè)。檢測(cè)手段包括用western blot分析三種細(xì)胞CYLD蛋白分泌水平；再將miR-454 mimics轉(zhuǎn)染至具有CYLD3'-UTR突變基因的SW480細(xì)胞,將這種細(xì)胞通過(guò)熒光素酶活性測(cè)定法與miR-454 mimics, miR-454 inhibitor轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞和正常SW480細(xì)胞比較CYLD基因表達(dá)情況,驗(yàn)證miR-454與CYLD基因的結(jié)合位點(diǎn)。研究結(jié)果：western blot分析結(jié)果表明,miR-454 mimics顯著抑制了SW480細(xì)胞的CYLD蛋白水平,而miR-454-in明顯促進(jìn)了CYLD蛋白的表達(dá)。熒光素酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示,在miR-454 mimics轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞中可以觀察到熒光素酶活性減少,而且其減少幅度與轉(zhuǎn)染的量呈線(xiàn)性相關(guān),然而在miR-454-in轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞中因?yàn)閷?duì)miR-454受到抑制而使CYLD基因的熒光素酶活性增加。同時(shí),轉(zhuǎn)染進(jìn)入的miR-454基因?qū)?’-UTR突變型SW480細(xì)胞的熒光素酶活性沒(méi)有影響。將得到這幾個(gè)結(jié)果綜合來(lái)看,可以確定CYLD是miR-454的目的基因,3’-UTR是miR-454的作用位點(diǎn)。研究結(jié)論：MiR-454通過(guò)結(jié)合3’-UTR直接與CYLD結(jié)合,降低其表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)四研究目的：miR-454對(duì)有關(guān)癌細(xì)胞增殖的其他基因的影響研究方法：以上的結(jié)果已經(jīng)表明,mir-454能促進(jìn)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,CYLD是miR-454的直接目標(biāo)。之前的報(bào)道的研究表明CYLD與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。我們對(duì)兩種關(guān)鍵的細(xì)胞增殖調(diào)控因子c-Myc以及cyclin Dl蛋白的表達(dá)水平也進(jìn)行了檢測(cè)。c-Myc基因是一個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子,其靶基因?qū)?xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡和其他細(xì)胞功能有重要作用,細(xì)胞周期蛋白cyclin D1也屬于被c-Myc基因調(diào)控之列。我們通過(guò)western blot的方法檢測(cè)c-Myc基因和cyclin D1蛋白在對(duì)照SW480細(xì)胞,轉(zhuǎn)染miR-454 mimics和miR-454-in的SW480細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控。研究結(jié)果：western blot檢測(cè)結(jié)果表明,相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞,cyclin D1和c-myc的表達(dá)在轉(zhuǎn)染miR-454mimics的SW480細(xì)胞中上調(diào),但在轉(zhuǎn)染miR-454-in的SW480細(xì)胞中降低。這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)證明miR-454對(duì)CRC細(xì)胞增殖的起到重要作用。研究結(jié)論：總而言之,我們的研究結(jié)果表明,miR-454調(diào)節(jié)了細(xì)胞增殖的調(diào)控因子cyclin D1和c-myc基因,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生相關(guān)作用。實(shí)驗(yàn)五研究目的：miR-454抑制CYLD表達(dá)與其促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的關(guān)系研究方法：為了進(jìn)一步研究CYLD的減少在miR-454增強(qiáng)CRC細(xì)胞增殖中的作用,我們首先研究了CYLD下調(diào)對(duì)CRC細(xì)胞增殖的影響。我們將CYLD的兩種siRNA (Small interfering RNA):CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2轉(zhuǎn)染入已先期轉(zhuǎn)染miR-454-in的SW480細(xì)胞系中,用免疫印跡分析(western blot)檢測(cè)CYLD在相應(yīng)SW480細(xì)胞系中的表達(dá),利用平板克隆形成,錨定非依賴(lài)生長(zhǎng)分析檢測(cè)相應(yīng)SW480細(xì)胞系的增殖情況。研究結(jié)果：免疫印跡分析表明, CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2均能有效降低CYLD在轉(zhuǎn)染了mir-454-in的SW480細(xì)胞中的表達(dá),形成了CYLD沉默。平板克隆形成,錨定非依賴(lài)生長(zhǎng)分析顯示在轉(zhuǎn)染了mir-454-in的SW480細(xì)胞中的CYLD沉默對(duì)細(xì)胞增殖中起到加強(qiáng)作用。總而言之,這些結(jié)果證實(shí),直接的CYLD表達(dá)下調(diào)是是miR-454誘導(dǎo)CRC細(xì)胞增殖的必要條件。研究結(jié)論：CYLD的抑制是miR-454誘導(dǎo)CRC細(xì)胞增殖的必要條件
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 梁燕華,楊森,張學(xué)軍;多發(fā)性家族性毛發(fā)上皮瘤的臨床和遺傳特征分析[J];食品與藥品;2005年11期

2 ;The effect of C-terminal fragment of JNK2 on the stability of p53 and cell proliferation[J];Cell Research;2004年05期

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本文編號(hào)：1566208