本文關(guān)鍵詞： 肌萎縮側(cè)索硬化 超氧化物歧化酶1 TDP-25 ScAAV9-hIGF-1 線(xiàn)粒體凋亡 線(xiàn)粒體自噬 線(xiàn)粒體膜電位 CRISPR-Cas9　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,在腦干,皮層和脊髓中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元逐漸退化,從而引起肌肉癱瘓。大多數(shù)患者在疾病發(fā)病后三至五年內(nèi)死于呼吸衰竭。大部分ALS病例是散發(fā)性的(s ALS),而10%是家族性的(f ALS)。20%的f ALS由突變體超氧化物歧化酶1(SOD1)基因引起。最新研究描述了其他重要的ALS誘導(dǎo)突變,包括反應(yīng)性反應(yīng)DNA結(jié)合蛋白43(TDP-43)和染色體9開(kāi)放閱讀框架72(C9ORF72)。我們對(duì)這種疾病的確切原因和病理生理學(xué)知之甚少。而這一疾病沒(méi)有有效的治療方法,因此理解這種疾病的發(fā)病機(jī)制有助于探索新的治療手段。越來(lái)越多的證據(jù)表明線(xiàn)粒體功能障礙在神經(jīng)退行性疾病,包括亨廷頓舞蹈病,帕金森病,阿爾茨海默病和肌萎縮性側(cè)索硬化癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。線(xiàn)粒體在氧化應(yīng)激,線(xiàn)粒體自噬,谷氨酸興奮性毒性和內(nèi)源性凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。在ALS的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,在運(yùn)動(dòng)功能障礙之前就存在線(xiàn)粒體的腫脹和空泡化。線(xiàn)粒體異常在疾病進(jìn)展過(guò)程中逐漸發(fā)展。線(xiàn)粒體是決定細(xì)胞死亡和存活的主要細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器。內(nèi)源性凋亡途徑在這個(gè)細(xì)胞器中啟動(dòng),老化的和功能失調(diào)的線(xiàn)粒體通過(guò)線(xiàn)粒體自噬被清除。最近,基因治療成為一種有效的治療手段,通過(guò)自我互補(bǔ)(sc)腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)的人胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(hIGF-1)的研究已經(jīng)顯示其對(duì)ALS小鼠模型的積極治療作用。在本研究中,我們應(yīng)用嗜神經(jīng)的腺相關(guān)病毒血清9型(AAV9)攜帶編碼雙鏈的人IGF-1基因(scAAV9-hIGF-1)作用于TDP-25穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及經(jīng)肌肉注射的途徑干預(yù)G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠,觀察到在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白(Bcl-xl,Bcl2)的表達(dá)和下調(diào)促凋亡蛋白(Bax,Bak,Cytochrome C)內(nèi)源性凋亡途徑被激活,線(xiàn)粒體自噬也在scAAV9-hIGF-1處理后被激活。我們證明了線(xiàn)粒體電跨膜電位增加和異常線(xiàn)粒體的轉(zhuǎn)化。此外,為了證實(shí)這些發(fā)現(xiàn),使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在SOD1G93A小鼠模型中敲除IGF-1。我們發(fā)現(xiàn)IGF-1對(duì)線(xiàn)粒體的保護(hù)作用在基因敲降后下降。這些新的發(fā)現(xiàn)表明IGF-1在ALS小鼠和細(xì)胞模型中強(qiáng)烈保護(hù)了線(xiàn)粒體,以保護(hù)線(xiàn)粒體功能為靶向的治療可能有希望治療ALS。我們經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)類(lèi)似報(bào)道極少。第一部分scAAV9-hIGF-1對(duì)ALS細(xì)胞模型線(xiàn)粒體的作用及其機(jī)制目的:我們對(duì)ALS細(xì)胞模型TDP-25穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系干預(yù)scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP,觀察線(xiàn)粒體膜電位、線(xiàn)粒體形態(tài)及線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡通路及自噬通路蛋白含量變化,探索基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hIGF-1對(duì)ALS細(xì)胞模型線(xiàn)粒體的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法:我們選取TDP-25穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系作為細(xì)胞模型,在細(xì)胞培養(yǎng)液中給予不同濃度scAAV9-hIGF-1干預(yù),利用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒CCK8測(cè)定不同濃度的細(xì)胞活力;利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)液中hIGF-1的含量;進(jìn)一步采用蛋白免疫印跡方法測(cè)定scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP作用不同時(shí)間點(diǎn)的GFP及VDAC的表達(dá),從而選取作用的最佳濃度及時(shí)間。采用該濃度及時(shí)間進(jìn)行下一步試驗(yàn)。試驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中給予scAAV9-hIGF-1,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中給予AAV9-GFP,應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞中線(xiàn)粒體的形態(tài)學(xué)變化;采用流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化;新鮮取材提取細(xì)胞線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法分析Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62的蛋白含量變化。結(jié)果:1在TDP-25穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)液中給予不同濃度scAAV9-hIGF-1干預(yù),應(yīng)用CCK8測(cè)定在1×107vg/ul濃度時(shí)細(xì)胞活力最好,與對(duì)照組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)液中hIGF-1的含量均明顯高于對(duì)照組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。GFP的表達(dá)具有時(shí)間依賴(lài)性,隨時(shí)間增加而增長(zhǎng),而VDAC的表達(dá)在60小時(shí)達(dá)到高峰,隨后下降。細(xì)胞在顯微鏡下觀察熒光結(jié)果與蛋白印跡結(jié)果相同,從而選取1×107vg/ul濃度作用60小時(shí)。2透射電鏡觀察GFP組細(xì)胞中線(xiàn)粒體嵴消失、斷裂、空泡化、胞漿水腫、核染色質(zhì)疏松,而IGF-1組線(xiàn)粒體形態(tài)為長(zhǎng)橢圓形,未見(jiàn)嵴消失、空泡化等現(xiàn)象。3對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化,GFP組線(xiàn)粒體膜電位低于IGF-1組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。4提取細(xì)胞線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法,顯示在IGF-1組的線(xiàn)粒體組分中,Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ的蛋白含量升高,Bax、Bak、P62的蛋白含量下降,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中升高,細(xì)胞組分中下降,提示在IGF-1組Cytochrome C主要存在于線(xiàn)粒體中,而在GFP組,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中下降,細(xì)胞組分中升高,提示Cytochrome C釋放到胞漿中,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:IGF-1可以保護(hù)ALS細(xì)胞模型中的線(xiàn)粒體,IGF-1通過(guò)提高線(xiàn)粒體膜電位,改善線(xiàn)粒體形態(tài),抑制內(nèi)源性凋亡通路中的促凋亡蛋白,升高抗凋亡蛋白的表達(dá),促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬,從而起到保護(hù)線(xiàn)粒體的作用。第二部分ALS小鼠模型肌肉注射scAAV9-hIGF-1對(duì)線(xiàn)粒體的作用及其機(jī)制目的:我們采用嗜神經(jīng)性的腺相關(guān)病毒血清型9(AAV9)攜帶的編碼雙鏈的人胰島素生長(zhǎng)因子1-IGF-1基因(scAAV9-hIGF-1)經(jīng)肌肉注射途徑干預(yù)60天齡G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠,觀察干預(yù)后其線(xiàn)粒體形態(tài)學(xué)變化、線(xiàn)粒體膜電位改變及線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡通路及自噬通路蛋白含量變化,探索基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hIGF-1對(duì)ALS小鼠線(xiàn)粒體的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法:我們采取美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的肌萎縮側(cè)索硬化的轉(zhuǎn)基因小鼠G93A-SOD1及野生型WT-SOD1為動(dòng)物模型,應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)SOD1基因進(jìn)行DNA鑒定,鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的同窩轉(zhuǎn)基因G93A-SODl雌性小鼠及同年齡的野生型WT小鼠經(jīng)隨機(jī)配對(duì)作為研究對(duì)象。在G93A-SODl及WT-SOD1小鼠60天齡時(shí),同窩陽(yáng)性G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠采用隨機(jī)的方法分配到治療組肌肉注射scAAV9-hIGF-1,對(duì)照組肌肉注射AAV9-GFP,及陰性對(duì)照同年齡WT-SOD1各13對(duì)。在肌肉注射后約40-50天時(shí),其中3對(duì)利用4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定,通過(guò)免疫組化染色觀察IGF-1在腰髓神經(jīng)元中的表達(dá),免疫熒光染色觀測(cè)腰髓組織GFP的表達(dá)特點(diǎn);1對(duì)經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定后用透射電鏡觀察腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中線(xiàn)粒體的形態(tài)學(xué)變化;3對(duì)用新鮮取材的方法提取小鼠脊髓細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化;6對(duì)快速新鮮取材提取腰髓線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法分析Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62的蛋白含量變化。結(jié)果:1所有實(shí)驗(yàn)組的小鼠經(jīng)PCR方法進(jìn)行DNA鑒定后,確定為SOD1基因陽(yáng)性G93A-SOD1及野生型WT-SOD1的雌鼠。2 60天齡G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉內(nèi)注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP,約40天后4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定,免疫熒光染色觀測(cè)腰髓組織GFP的表達(dá)主要在神經(jīng)元,免疫組化染色觀察IGF-1在腰髓神經(jīng)元中也存在表達(dá)。3肌肉內(nèi)注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及對(duì)照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天齡時(shí)經(jīng)過(guò)2.5%戊二醛溶液固定,透射電鏡觀察線(xiàn)粒體形態(tài)變化,GFP組線(xiàn)粒體存在嵴消失、空泡化、胞漿水腫、核染色質(zhì)疏松,而IGF-1組線(xiàn)粒體形態(tài)與WT組相似,為長(zhǎng)橢圓形,未見(jiàn)嵴消失、空泡化等現(xiàn)象。4肌肉內(nèi)注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及對(duì)照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天齡時(shí)提取小鼠脊髓細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化,GFP組線(xiàn)粒體膜電位低于IGF-1組及WT組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。5肌肉內(nèi)注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及對(duì)照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天齡時(shí)快速新鮮取材提取腰髓線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法,顯示在IGF-1組及WT組的線(xiàn)粒體組分中,Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ的蛋白含量升高,Bax、Bak、P62的蛋白含量下降,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中升高,細(xì)胞組分中下降,提示在IGF-1組及WT組Cytochrome C主要存在于線(xiàn)粒體中,而在GFP組,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中下降,細(xì)胞組分中升高,提示Cytochrome C釋放到胞漿中,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:IGF-1可以保護(hù)ALS動(dòng)物模型中的線(xiàn)粒體,IGF-1通過(guò)提高線(xiàn)粒體膜電位,改善線(xiàn)粒體形態(tài),抑制內(nèi)源性凋亡通路中的促凋亡蛋白,升高抗凋亡蛋白的表達(dá),促進(jìn)線(xiàn)粒體自噬,從而起到保護(hù)線(xiàn)粒體的作用。第三部分ALS小鼠鞘內(nèi)注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9對(duì)線(xiàn)粒體的作用及其機(jī)制目的:我們利用CRISPR-Cas9系統(tǒng),通過(guò)給予G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠鞘內(nèi)注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9,探索敲降G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠IGF-1的m RNA對(duì)其線(xiàn)粒體形態(tài)學(xué)變化、線(xiàn)粒體膜電位改變及線(xiàn)粒體相關(guān)凋亡通路及自噬通路蛋白含量變化,探索基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hIGF-1對(duì)ALS小鼠線(xiàn)粒體的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法:我們采取美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)的肌萎縮側(cè)索硬化的轉(zhuǎn)基因小鼠G93A-SOD1為動(dòng)物模型,應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)SOD1基因進(jìn)行DNA鑒定,鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的同窩轉(zhuǎn)基因G93A-SODl雌性小鼠隨機(jī)配對(duì)作為研究對(duì)象。在G93A-SODl小鼠30天齡時(shí),同窩陽(yáng)性G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因雌性小鼠采用隨機(jī)的方法分配到實(shí)驗(yàn)組鞘內(nèi)注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9,對(duì)照組鞘內(nèi)注射scAAV9-sg RNA-Lac Z-Cas9各10對(duì)。在鞘內(nèi)注射后約50-60天時(shí),其中1對(duì)經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定后用透射電鏡觀察腰髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中線(xiàn)粒體的形態(tài)學(xué)變化;3對(duì)用新鮮取材的方法提取小鼠脊髓細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化;6對(duì)快速新鮮取材提取腰髓線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法分析IGF-1、Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62、optineurin的蛋白含量變化。結(jié)果:1在G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠中敲降IGF-1,實(shí)驗(yàn)組線(xiàn)粒體存在嵴消失、空泡化、胞漿水腫、核染色質(zhì)疏松,而對(duì)照組線(xiàn)粒體形態(tài)為長(zhǎng)橢圓形,未見(jiàn)嵴消失、空泡化等現(xiàn)象。2提取小鼠脊髓細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析線(xiàn)粒體膜電位變化,實(shí)驗(yàn)組線(xiàn)粒體膜電位顯著低于對(duì)照組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。3實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠在80-90天齡癥狀具有差異時(shí)快速新鮮取材提取腰髓線(xiàn)粒體及胞漿蛋白,經(jīng)過(guò)蛋白免疫印跡方法,顯示在實(shí)驗(yàn)組的線(xiàn)粒體組分中,IGF-1、Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ、optineurin的蛋白含量下降,Bax的蛋白含量升高,P62的蛋白含量無(wú)明顯變化,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中下降,細(xì)胞組分中升高,提示在實(shí)驗(yàn)組Cytochrome C釋放到胞漿中,而在對(duì)照組,Cytochrome C在線(xiàn)粒體組分中升高,細(xì)胞組分中下降,提示Cytochrome C主要存在于線(xiàn)粒體中,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:在ALS小鼠脊髓中敲降IGF-1使線(xiàn)粒體功能障礙進(jìn)一步加劇,線(xiàn)粒體膜電位下降,線(xiàn)粒體空泡化,形態(tài)異常,促凋亡蛋白表達(dá)升高,抗凋亡蛋白表達(dá)下降,抑制線(xiàn)粒體自噬通路,線(xiàn)粒體損傷惡化,疾病進(jìn)一步加重。根據(jù)以上研究結(jié)果我們推論在ALS的發(fā)病過(guò)程中,線(xiàn)粒體功能障礙占有一定因素,線(xiàn)粒體是細(xì)胞的能量工廠,一旦線(xiàn)粒體功能障礙,細(xì)胞不能進(jìn)行正常代謝,啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),不能通過(guò)自噬清除異常線(xiàn)粒體,疾病會(huì)惡化加劇。而IGF-1可以對(duì)這一過(guò)程產(chǎn)生保護(hù)作用,但其在線(xiàn)粒體自噬通路中的作用亟待進(jìn)一步研究。通過(guò)基因載體表達(dá)hIGF-1對(duì)ALS小鼠及細(xì)胞模型保護(hù)了異常的線(xiàn)粒體,為臨床ALS疾病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),保護(hù)線(xiàn)粒體功能為靶向的治療可能有希望治療ALS。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R744.8

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