本文關(guān)鍵詞： 急性髓系白血病 血管新生 VEGFA miR-638 MVD　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景急性白血病是血液系統(tǒng)常見的惡性疾病,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢,盡管在過去的十年,對該疾病的診斷及治療方面有長足的進步,研究其發(fā)病機制和相應的治療策略仍然是血液學界重要的課題。以往的研究中,學者們大都關(guān)注白血病干細胞本身如細胞表面抗原變化、細胞遺傳學改變、基因的重組、突變等。近些年的研究資料顯示,骨髓造血微環(huán)境的改變也是參與其中的重要因素,白血病細胞在造血微環(huán)境中增殖,并不斷促進其發(fā)生變化,造血微環(huán)境的改變也為白血病細胞提供了必要的生長條件,二者共同促進疾病的發(fā)生發(fā)展。骨髓血管新生是骨髓造因微環(huán)境改變的一項重要病理過程,其主要參與者包括血管內(nèi)皮細胞、細胞因子、信號傳導通路及白血病干細胞本身。在這個過程中,參與其中的誘導因子表達上調(diào),而抑制因子相對減弱,刺激循環(huán)內(nèi)皮細胞向腫瘤周圍遷移、增殖,形成新生的血管。在眾多因子中,目前認為起關(guān)鍵作用的是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),它在血液系統(tǒng)腫瘤中的研究在不斷進展中。上世紀90年代,骨髓血管新生現(xiàn)象在多發(fā)性骨髓瘤患者中被發(fā)現(xiàn)。隨后的研究發(fā)現(xiàn),這種現(xiàn)象也同樣存在于急性白血病中。隨著分子生物學的飛速進展,人們對腫瘤治療的目標,已不再滿足于細胞和蛋白水平。一般認為,下調(diào)特定基因的mRNA表達策略是研究基因功能及有希望治療腫瘤的有效途徑。在分子水平控制基因表達已經(jīng)成為重要的課題,miRNA的發(fā)現(xiàn),給這個課題帶來了新的希望。MicroRNAs(miRNAs)在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控起著重要的作用,其本身并不改變基因序列,而是與靶基因互相作用,通過上調(diào)或抑制其表達而發(fā)揮調(diào)控作用。miRNAs參與了真核生物幾乎所有的生物學過程,另外被發(fā)現(xiàn)的miRNAs多數(shù)位于脆性位點與癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域,也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。多個研究報告表明,miRNA參與了內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持,miRNA表達譜往往是觀察各類疾病的生物學指標。許多miRNAs在血漿中能被檢測出來,隨著分子生物學技術(shù)的不斷成熟,其不僅可能成為一些疾病的生物學標記,還可能對疾病分型、評估療效及判斷預后有重要參考意義�；钴S的血管生成是導致腫瘤患者快速復發(fā)和低生存率的重要原因。眾多miRNAs參與了這個過程。然而,確定miRNA與血管新生的關(guān)系是十分復雜過程,具有巨大的挑戰(zhàn)性,因為一個miRNA可能對應數(shù)百或甚至數(shù)千個目的基因,一種基因可以受數(shù)目眾多的miRNAs調(diào)控。根據(jù)數(shù)據(jù)庫基礎資料及前期我們對AML患者血漿中miRNAs表達譜的篩選研究,發(fā)現(xiàn)miR-638可能以"抑癌基因"角色參與腫瘤血管生成過程,然而其表達情況及具體機制尚未清楚。研究目的觀察急性髓系白血病患者骨髓血管新生情況,并對骨髓單個核細胞VEGFA-mRNA及miR-638水平進行檢測,根據(jù)臨床資料及檢測結(jié)果,分析二者在AMIL血管新生中可能的作用。進一步以白血病細胞系為研究對象,上調(diào)或下調(diào)miR-638表達水平,觀察VEGFAmRNA及蛋白表達變化。通過臨床觀察及基礎研究,探討miR-638、VEGFA在骨髓血管生成中的作用,并為尋找新的生物學標志物及新的治療方法奠定基礎。研究方法臨床研究:1.選取77例急性髓系白血病患者及21列正常人為觀察對象,免疫組化法以Anti-vWF抗體標記微血管內(nèi)皮細胞,檢測骨髓微血管密度(MVD);收集并分離骨髓單個核細胞,qTR-PCR法檢測miR-638、VEGFAmRNA表達情況。并分別分析MVD、VEGFAmRNA、miR-638與臨床特征的關(guān)系及三者表達水平相關(guān)性。2.標準化療1周期后,評估緩解狀態(tài),收集標本,再次檢測骨髓MVD及單個核細胞VEGFAmRNA、miR-638表達水平,與治療前進行配對比較并分析相應的變化�；A研究:1.以白血病細胞系K562、HL60和人臍靜脈細胞系HUVECs為研究對象,常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng),檢測miR-638、VEGFA表達情況。2.上調(diào)/抑制miRNA-638表達實驗質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-638mimics及其抑制物miR-638 inhibitor于K562和HL60細胞株中,用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后細胞miR-638、VEGFAmRNA表達水平,應用Western blot法檢測VEGFA蛋白水平變化。3.熒光素酶基因報告實驗根據(jù)miR-638與VEGFA3'-UTR端結(jié)合位點設計引物。PCR擴增后雙酶切,連接到pmirGLO質(zhì)粒載體中,定點突變VEGFA3'-UTR相應的種子序列并連接于載體中,由此分別構(gòu)建了 VEGFA野生型3'UTR和突變型3'UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒,與miR-638共轉(zhuǎn)染K562和HL60細胞,以Negative control作為陰性對照,培養(yǎng)48小時后加入底物發(fā)光,檢測熒光水平。4.Transwell細胞共培養(yǎng)實驗以內(nèi)皮細胞HUVECs為觀察對象,應用Transwell小室(聚酯膜的孔徑為0.4μm)與轉(zhuǎn)染miR-638及miR-638inhibitor的K562、HL60細胞共培養(yǎng),模擬白血病細胞對內(nèi)皮細胞增殖的影響,應用MTT法檢測HUVECs的增殖情況。研究結(jié)果臨床研究結(jié)果:1.應用免疫組化法檢測正常人及AML患者微血管密度(MVD),高倍顯微鏡下(100×)觀察骨髓切片,發(fā)現(xiàn)vWF標記的AML患者骨髓微血管的形態(tài)與正常人存在差異。77例初發(fā)AML患者MVD明顯高于正常對照組,在伴有髓外浸潤者尤為顯著。經(jīng)標準化療1周期后,評估療效,達CR者60人,NR者17人。化療后患者骨髓MVD仍偏高。所有患者治療前后進行配對t檢驗,治療后MVD較治療前下降;CR組與NR組無統(tǒng)計學差異。2.qRT-PCR法檢測AML患者VEGFA mRNA相對表達含量,結(jié)果顯示,初發(fā)AML患者與正常組比較明顯增高,且在高原始細胞比例組(BM-blasts50%)VEGFAmRNA表達水平明顯高于50%組�；�1周期后,VEGFAmRNA表達水平仍偏高,與對照組比較有統(tǒng)計學意義;所有患者治療前后進行配對t檢驗,治療后VEGFAmRNA表達水平較治療前明顯下降。3.qRT-PCR法檢測骨髓單核核細胞miR-638表達,結(jié)果顯示,miR-638在初發(fā)AML表達下降,明顯低于正常對照組;經(jīng)1周期治療后與初發(fā)時進行配對比較,其表達上調(diào),有統(tǒng)計學差異;NR組miR-638表達水平仍偏低,與CR組比較有統(tǒng)計學差異。按臨床特征分析AML患者骨髓單個核細胞miR-638表達情況,其表達骨髓增生程度,白血病類型、有無髓外浸潤及細胞遺傳學改變無相關(guān)性。按骨髓原始細胞比例分組,AML患者骨髓原始細胞50%組表達水平明顯低于50%組,有統(tǒng)計學差異。4.將所有AML患者MVD與VEGFAmRNA及miR-638相對表達含量進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,MVD與VEGFAmRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.583,P0.05);miR-638 與 VEGFAmRNA 呈顯著負相關(guān)(r=-0.389,P0.05)。5.生存分析骨髓MVD偏低組患者總生存期較偏高組明顯延長,VEGFAmRNA及miR-638相對表達含量與生存期無明顯相關(guān)性。基礎研究結(jié)果:1.miR-638在白血病細胞株K562、HL60中的表達水平較正常單個核細胞明顯減低。以 miR-638mimics 和 miR-638 inhibitor 轉(zhuǎn)染 K562 和 HL60 細胞株,轉(zhuǎn)染后應用qRT-PCR法進行檢測miR-638表達情況。轉(zhuǎn)染miR-638mimics的細胞株,其表達水平上調(diào),明顯高于Negative Control組;而轉(zhuǎn)染miR-638inhibitor的細胞株,表達水平下調(diào),與Negative Control比較,有統(tǒng)計學差異。2.轉(zhuǎn)染miR-638mimics的細胞,VEGFAmRNA和蛋白表達水平下降,較Negative Control 組有明顯差異,而轉(zhuǎn)染 miR-638inhibitor 的細胞 VEGFAmRNA和蛋白表達水平與Negative Control組相比較,無明顯差異。3.熒光素酶報告基因?qū)嶒濾EGFA-3'UTR野生型報告質(zhì)粒與miR-638共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性較對照組及突變組比較明顯下降,而突變型VEGFA-3'UTR報告質(zhì)粒與miR-638共轉(zhuǎn)染,熒光素酶活性與對照組相比,無明顯差異。此結(jié)果證實,VEGFAmRNA的3'UTR端是miR-638的直接作用靶點,miR-638通過靶向VEGFA-3'UTR調(diào)節(jié)其蛋白表達,進而以揮其對血管生成的調(diào)控作用。4.應用Transwell細胞共培養(yǎng)技術(shù),觀察miR-638轉(zhuǎn)染后的白血病細胞系K562、HL60對靜脈內(nèi)皮細胞的影響,并用MTT法檢測HUVECs的增殖能力。結(jié)果顯示,K562細胞轉(zhuǎn)染miR-638mimcs組紫外光吸光度值(OD)較miR-638 inhibitor組及對照組明顯減低,miR-638 inhibitor組較對照組比較無明顯差異;HL60細胞轉(zhuǎn)染miR-638mimcs組OD值較miR-638 inhibitor組及對照組明顯減低,miR-638 inhibitor組較對照組明顯升高,有統(tǒng)計學差異。研究結(jié)論骨髓血管新生是急性髓系白血病重要的病理過程,骨髓微血管密度的檢測對白血病判斷預后有重要意義。miR-638在急性髓系白血病中表達減低,與血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)呈負相關(guān),VEGFAmRNA的3'UTR端是miR-638的直接作用靶點,VEGFAmRNA是miR-638的靶基因,可以通過對VEGFA的調(diào)控間接對內(nèi)皮細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用從而參與白血病骨髓血管新生。miR-638可能成為檢測骨髓血管新生的生物學標記物及白血病抗血管新生治療的作用靶點。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R733.71

【參考文獻】

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1 Yongrui Liu;Yuan He;Feifei Yang;Xiaonan Cong;Jinhua Wang;Shihong Peng;Dan Gao;Weifang Wang;Liping Lan;Xuexiang Ying;Mingyao Liu;Yihua Chen;Zhengfang Yi;;A novel synthetic small molecule YF-452 inhibits tumor growth through antiangiogenesis by suppressing VEGF receptor 2 signaling[J];Science China(Life Sciences);2017年02期

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本文編號：1535407