發(fā)布時(shí)間：2018-02-25 04:17

  本文關(guān)鍵詞： 新生兒腦出血 Ⅱ型大麻素受體 米諾環(huán)素 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換 MAPK/ERK CX3CR1/CX3CL1　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的新生兒腦出血是新生兒主要的腦損傷形式之一,表現(xiàn)為新生兒生發(fā)基質(zhì)出血(Germinal Matrix Hemorrhage,GMH),主要由新生兒腦生發(fā)基質(zhì)層血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)發(fā)育不全、外力作用,如產(chǎn)道壓力等,誘導(dǎo)血管破裂出血所至。由于近年來圍產(chǎn)技術(shù)以及重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的提高,越來越多的GMH早產(chǎn)兒得以存活,可能伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,如腦積水(hydrocephalus),腦萎縮(cerebral atrophy)、腦癱(cerebral palsy)以及炎癥灶機(jī)化形成癲癇灶等。GMH及其神經(jīng)后遺癥所帶來的社會—經(jīng)濟(jì)壓力備受關(guān)注,因此探討GMH病理生理特點(diǎn)、研究藥物干預(yù)靶點(diǎn)具有重大臨床意義。GMH的嚴(yán)重程度主要與胚胎期時(shí)間長短相關(guān),文獻(xiàn)報(bào)道稱在37周胚胎期出生的新生兒中有15%是未成熟的,其中有50%早產(chǎn)兒會在胚胎第24周至胚胎第30周誘發(fā)GMH。從病理角度出發(fā),基質(zhì)層(Germinal Matrix,GM)是神經(jīng)元前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元及部分膠質(zhì)細(xì)胞所在地,也是GMH出血部位易發(fā)點(diǎn)。GM層在胚胎期為凝膠狀,富含細(xì)胞及血管且該處毛細(xì)血管床的膠原蛋白層和基底膜層沒有緊密連接蛋白和膠質(zhì)細(xì)胞足突包被。大量細(xì)胞處于分裂期,代謝旺盛、耗氧量大,微血管增加是必然的,在血流量極大而血管骨架結(jié)構(gòu)不完整的情況下,血管破裂出血就會發(fā)生,該理論是公認(rèn)的GMH發(fā)病原因。由于GM臨近室管膜下區(qū),嚴(yán)重時(shí)血腫自會突破GM層進(jìn)入腦室內(nèi)形成GMH,是否破入腦室已成為目前GMH分級的重要標(biāo)準(zhǔn),I級破入腦室10%、II級破入腦室50%,III級破入腦室50%且伴有腦室擴(kuò)張,IV級伴有嚴(yán)重的梗阻性腦積水。John Z等在2012年首次報(bào)道了通過立體定位在新生第7天(p7)大鼠微量注入Ⅶ型膠原酶,破壞微血管外基膜引起出血,很好的模擬GMH后腦積水、神經(jīng)功能障礙的后遺癥,目前被廣泛用于GMH的藥物靶點(diǎn)研究。神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)是神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)下先天性免疫即炎癥應(yīng)答,是機(jī)體自主防御修復(fù)機(jī)制啟動的結(jié)果。然而研究表明,過度的炎癥反應(yīng)將釋放大量的炎癥損傷因子,在繼發(fā)性腦損傷中扮演重要角色。腦出血后血液成分流出脈管,紅細(xì)胞裂解并釋放血紅蛋白、凝血酶以及含鐵血黃素等活性成分,激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞占中樞神經(jīng)系膠質(zhì)細(xì)胞的20-25%,是調(diào)控出血性腦卒中后繼發(fā)炎癥損傷的關(guān)鍵細(xì)胞,具有細(xì)胞形態(tài)動態(tài)變化特點(diǎn),根據(jù)細(xì)胞周圍環(huán)境變化,并調(diào)控周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡、分化、增殖等。既往研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞可被分為M0、M1、M2三種形態(tài),其中M0是小膠質(zhì)細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài),實(shí)時(shí)監(jiān)控顱內(nèi)細(xì)胞或微環(huán)境并作出相應(yīng)變化;M1是激活后小膠質(zhì)細(xì)胞,阿米巴狀,表現(xiàn)為顱內(nèi)巨噬細(xì)胞,具備識別、趨化、吞噬等效應(yīng),在血液成分溢出脈管后,大量M0小膠質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)并激活為M1型,在趨化因子等參與下游走到異物(溢出成分)處,進(jìn)行吞噬、消化,在后期釋放大量消化產(chǎn)物如腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-6)等,甚至自身裂解成為異物,主要參與細(xì)胞毒作用。研究報(bào)道M2型小膠質(zhì)細(xì)胞亦是活性狀態(tài)的一種,在生理狀態(tài)下,參與神經(jīng)纖維束的修剪,維護(hù)神經(jīng)纖維連接的有序性;病理狀態(tài)下可能參與受損神經(jīng)纖維連接、與神經(jīng)細(xì)胞相互作用,促進(jìn)神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖、分化、遷移等再生過程。據(jù)此,出血性腦卒中后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化的研究頗具科學(xué)價(jià)值,然而小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化的調(diào)控機(jī)制仍不清楚,新生兒腦出血是作為研究小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化與神經(jīng)纖維束以及神經(jīng)元相互作用病理過程的最佳選擇。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system,ECS)是機(jī)體廣泛存在的配體-受體系統(tǒng),參與某些生理、病理反應(yīng),如能量消耗、心血管疾病、腫瘤以及神經(jīng)退行性疾病等。ECS的內(nèi)源性配體主要有anandamide(Narachidonoylethanolamine,AEA)以及2-arachidonoylglycerol(2-AG)兩種。根據(jù)機(jī)體需要,AEA和2-AG可由細(xì)胞膜上花生四烯酸合成,與細(xì)胞膜上兩種不同的G蛋白偶聯(lián)受體(Cannabinoid Receptor1/2,CB1/2)直接結(jié)合,發(fā)揮效應(yīng)。CB1R與成癮性密切相關(guān),其研究多集中于神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、創(chuàng)傷后遺癥以及阿爾茲海默癥等;CB2R的發(fā)現(xiàn)較晚于CB1R,被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)病理狀態(tài)下參與細(xì)胞調(diào)控的主要膜受體。大量研究證實(shí)CB2R參與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)應(yīng),認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞上CB2R的表達(dá)能有效減輕神經(jīng)炎癥介導(dǎo)的腦損傷,但具體機(jī)制及調(diào)控靶點(diǎn)仍不清楚。結(jié)合前期工作基礎(chǔ),本研究使用Ⅶ型膠原酶誘導(dǎo)p7新生大鼠腦出血,模擬臨床上新生兒腦出血(GMH)的病理生理特點(diǎn),并通過影像學(xué)、行為學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn);針對GMH后腦小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)生物學(xué)特點(diǎn),以內(nèi)源性大麻素受體(CB2R)作為干預(yù)靶點(diǎn),探討CB2R激活調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換以及與神經(jīng)細(xì)胞相互作用的細(xì)胞、分子機(jī)制。1,為出血性腦卒中繼發(fā)神經(jīng)炎癥的調(diào)控提供新靶點(diǎn);2,為GMH及其后遺癥的臨床救治提供新思路;3,為防治GMH后神經(jīng)炎癥,改善預(yù)后提供新手段。第一部分Ⅱ型大麻素受體(CB2R)在新生兒腦出血后米諾環(huán)素介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中的作用及機(jī)制研究目的該部分研究為闡明米諾環(huán)素在新生兒GMH中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其抗炎機(jī)制是否通過激活內(nèi)源性CB2R實(shí)現(xiàn)。材料與方法研究采用Ⅶ型膠原酶(0.3U)立體定向微量注射入p7幼鼠右側(cè)生發(fā)基質(zhì)層構(gòu)建新生兒腦出血模型。通過腹腔注射米諾環(huán)素(45mg/kg)及選擇性CB2R抑制劑(AM630,1mg/kg)或選擇性激動劑(JWH133,1.5mg/kg)及相應(yīng)安慰劑組干預(yù)共198只幼鼠,使用免疫組織化學(xué)、免疫印跡技術(shù)以及ELISA技術(shù)等檢測內(nèi)源性CB2R、小膠質(zhì)細(xì)胞以及相應(yīng)炎癥因子,如IL-6,TGF-β以及TNF-α蛋白含量,使用PCR技術(shù)檢測相關(guān)m RNA水平,使用小動物MRI技術(shù)檢測各組幼鼠腦皮層厚度及腦室擴(kuò)張?bào)w積。結(jié)果腹腔注射米諾環(huán)素能增加GMH 24小時(shí)后CB2R表達(dá)量,同時(shí)減少早期神經(jīng)炎癥因子的釋放,減輕幼鼠腦含水量以及活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù);28天7.0T MRI T2加權(quán)像提示米諾環(huán)素可顯著減輕GMH誘導(dǎo)的腦室體積擴(kuò)大以及增加幼鼠腦皮層厚度。使用CB2R選擇性抑制劑AM630在誘導(dǎo)GMH前1小時(shí)腹腔注射可顯著逆轉(zhuǎn)米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。結(jié)論研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素具有減輕GMH后早期腦水腫,抑制神經(jīng)炎癥等保護(hù)效應(yīng),當(dāng)使用CB2R選擇性抑制劑時(shí)米諾還素的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)被抑制,證實(shí)米諾環(huán)素可能是通過上調(diào)細(xì)胞膜蛋白CB2R的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng),為GMH及其并發(fā)癥提供新的研究靶點(diǎn)。第二部分外源性激活CB2R改善GMH后繼發(fā)炎癥腦損傷的作用及機(jī)制研究目的通過體內(nèi)外研究證實(shí)外源性激活CB2R對GMH后小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化的作用以及MAPK/ERK的磷酸化在該過程中的作用。材料與方法在GMH幼鼠模型的基礎(chǔ)上,腹腔注射CB2R選擇性抑制劑(AM630,1mg/kg)或CB2R選擇性激動劑(JWH133,1.5mg/kg)。檢測內(nèi)源性大麻素受體激活后GMH介導(dǎo)的幼鼠腦水腫變化(腦水含量)、神經(jīng)元凋亡以及小膠質(zhì)細(xì)胞MAPK/ERK信號通路磷酸化情況;離體培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞,使用凝血酶(Thrombin,紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物之一)作為至傷物構(gòu)建離體腦出血單一因素環(huán)境,觀察小膠質(zhì)細(xì)胞在凝血酶以及JWH133干預(yù)后的增殖情況以及MAPK/ERK信號通路磷酸化程度。結(jié)果腹腔注射CB2R選擇性激動劑JWH133與注射米諾環(huán)素具有相似的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng),如減輕GMH誘導(dǎo)的腦水腫以及減輕腦室擴(kuò)張,減少血腫周圍小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化,同時(shí)JWH133能減少血腫周圍神經(jīng)元的凋亡。通過在體與離體實(shí)驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn)JWH133能抑制MAPK/ERK蛋白磷酸化水平,進(jìn)而減少活化小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化。結(jié)論外源性激活CB2R通過抑制GMH后小膠質(zhì)細(xì)胞MAPK/ERK磷酸化水平,減少激活小膠質(zhì)增殖、分化,同時(shí)減少神經(jīng)炎癥因子的釋放并干預(yù)繼發(fā)性腦損傷。該研究進(jìn)一步闡明CB2R在GMH后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為CB2R選擇性激動劑的臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。第三部分CB2R選擇性激動劑促進(jìn)GMH后神經(jīng)修復(fù)的作用及機(jī)制研究目的該部分?jǐn)M證實(shí)CB2R選擇性激動劑(JWH133)是否能在GMH后增加CX3CR1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,并上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)釋放,促進(jìn)神經(jīng)再生。材料與方法在CB2R選擇性抑制或激活的基礎(chǔ)上,幼鼠腦室內(nèi)立體定向微量注射CX3CR1sh RNA(預(yù)先構(gòu)建)。使用Brdu、M1小膠質(zhì)細(xì)胞以及M2小膠質(zhì)細(xì)胞特異性marker-CD68/CD206等檢測不同干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。使用7.0T MRI-DTI檢測CB2R激活后神經(jīng)纖維束損傷程度,再使用免疫熒光以及Western Blot技術(shù)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元前體細(xì)胞(Neuronal precursor cells,NPCs)的相互作用以及神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖等。結(jié)果在JWH133治療GMH幼鼠的基礎(chǔ)上,早期腦室內(nèi)注射CX3CR1 sh RNA以下調(diào)神經(jīng)系統(tǒng)CX3CR1表達(dá),發(fā)現(xiàn)JWH133能減少M(fèi)1型(CD68)活化小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,同時(shí)增加M2型(CD206)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JWH133通過增加小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1膜蛋白水平,促進(jìn)小膠質(zhì)下?lián)芟騇2形態(tài)轉(zhuǎn)換,并釋放大量神經(jīng)營養(yǎng)因子,如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、胰島素樣生長因子(IGF)等,促進(jìn)GMH損傷的神經(jīng)纖維束修復(fù)以及神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖、分化。結(jié)論研究證實(shí)CB2R選擇性激動劑促進(jìn)M1小膠質(zhì)細(xì)胞向M2形態(tài)轉(zhuǎn)換,釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,促進(jìn)損傷的神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。本研究證實(shí)CB2R激活是小膠質(zhì)細(xì)胞在病理狀態(tài)下自我調(diào)控機(jī)制啟動的結(jié)果,如果人為加以干預(yù),激活CB2R可達(dá)到抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥,同時(shí)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞從細(xì)胞毒型向神經(jīng)保護(hù)型轉(zhuǎn)換。該研究為出血性腦卒中后繼發(fā)炎癥損傷提供新的研究思路,為新生兒腦出血及其并發(fā)癥的臨床救治提供新策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34

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