本文關(guān)鍵詞： 帕金森病 軸突變性 微管 發(fā)病機(jī)制　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：帕金森病是一種目前發(fā)病率較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),并且有年輕化發(fā)展的趨勢(shì),現(xiàn)有的流行病學(xué)調(diào)查顯示其在50歲以上人群中的發(fā)病率約為1%。目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制仍不明確,或許源于帕金森病患者腦組織內(nèi)多巴胺水平的明顯下降,中腦部位多巴胺神經(jīng)元胞體的變性一直是帕金森病發(fā)病機(jī)制研究中的熱點(diǎn)。但越來越多的研究卻表明,相較于神經(jīng)元胞體的變性及壞死,多巴胺能神經(jīng)元軸突的損傷可能在帕金森病的發(fā)病中發(fā)揮了更為重要的作用。神經(jīng)元的軸突變性是指外源性或者內(nèi)源性的損傷因素作用于神經(jīng)元或者軸突后軸突所表現(xiàn)出的損傷過程,如局部腫脹、軸突斷裂等等,嚴(yán)重的軸突損傷會(huì)導(dǎo)致軸突內(nèi)細(xì)胞骨架成分的崩解及連續(xù)性喪失。在既往的研究中,軸突損傷及變性并未被人們作為一個(gè)獨(dú)立的過程而加以研究及對(duì)待,而是以神經(jīng)元胞體損傷的伴隨產(chǎn)物而加以研究,因此關(guān)于軸突損傷的報(bào)道局限于其是一種胞體損傷后的被動(dòng)反應(yīng)。然而隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)軸突變性不僅僅是一種被動(dòng)的反應(yīng),更是軸突對(duì)損傷因素的一種主動(dòng)反應(yīng)過程,并且該過程會(huì)逆行性的影響到神經(jīng)元胞體,因此,防止軸突變性在維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的完整性上可能發(fā)揮了更為重要的作用。在帕金森病模型中,作為多巴胺能神經(jīng)元軸突投射部位的紋狀體,其損傷時(shí)間要明顯早于中腦部位神經(jīng)元胞體本身,且其損傷程度更甚。而作為一個(gè)獨(dú)立的病理過程,軸突損傷的持續(xù)存在則會(huì)進(jìn)一步逆行性加重胞體的損傷。因此軸突變性在帕金森病發(fā)病中的作用和地位可能需要重新審視。因此將多巴胺能神經(jīng)元軸突變性作為一個(gè)新的突破口可能會(huì)對(duì)帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究帶來一個(gè)新的突破。第一部分:MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元軸突變性的研究目的:通過1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子(MPP+)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性的毒性作用,體外原代培養(yǎng)小鼠多巴胺能神經(jīng)元,應(yīng)用亞致死劑量MPP+持續(xù)作用于神經(jīng)元,在離體實(shí)驗(yàn)中觀察多巴胺能神經(jīng)元軸突變性情況,并進(jìn)一步探討神經(jīng)元胞體損傷與軸突變性的關(guān)系。方法:選擇C57BL/6小鼠胚胎(孕14d)中腦腹側(cè)組織進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元原代培養(yǎng),。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及10.0μM MPP+藥物實(shí)驗(yàn)組(亞致死劑量MPP+的濃度為預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得)。酪氨酸羥化酶(TH)可以選擇性的標(biāo)記多巴胺能神經(jīng)元,因此本研究中采用TH染色對(duì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記。通過熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡對(duì)TH染色陽性神經(jīng)元胞體的數(shù)量、突起數(shù)目和長(zhǎng)度分別在1h、2h、4h、8h、12h、24h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察,應(yīng)用TUNEL染色確定凋亡神經(jīng)元,應(yīng)用APP染色法進(jìn)一步明確軸突損傷的情況。結(jié)果:在MPP+作用的早期(2h內(nèi)),TH染色陽性神經(jīng)元軸突開始出現(xiàn)了損傷表現(xiàn),如軸突局部出現(xiàn)不規(guī)則膨大,順應(yīng)性變差,形態(tài)不規(guī)則等等,并且隨藥物作用時(shí)間的逐漸延長(zhǎng),熒光顯微鏡下可見TH染色陽性的神經(jīng)元軸突交匯而成的網(wǎng)狀交織密度開始逐漸下降,而軸突本身出現(xiàn)走形迂曲,變細(xì)縮短,甚至出現(xiàn)串珠樣變,嚴(yán)重者軸突崩解,作用24h后,大部分神經(jīng)元突起消失,部分僅殘存突起根部,神經(jīng)元胞體空虛形狀不規(guī)則。對(duì)比對(duì)照組,在10μM MPP+作用后4h,神經(jīng)元突起的數(shù)量開始下降(P0.05)并且損傷程度隨作用時(shí)間而加重,24h后,突起的數(shù)量下降了71%;對(duì)比對(duì)照組,MPP+作用后12h內(nèi)神經(jīng)元胞體的形態(tài)無明顯改變且數(shù)量無明顯變化(P0.05),但24h后,神經(jīng)元數(shù)量相較對(duì)照組下降了40%且胞體形狀不規(guī)則。應(yīng)用TUNEL染色示,2組相比較,MPP+作用后前12h內(nèi),二者凋亡細(xì)胞的數(shù)量并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而隨著MPP+作用時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)(24h后),相較于對(duì)照組,MPP+處理組凋亡神經(jīng)元的數(shù)量增加了29%。應(yīng)用APP染色法觀察軸突損傷可見,APP表達(dá)逐漸升高,且在初期其可見APP表達(dá)升高并在局部聚集。結(jié)論:亞致死劑量的MPP+作用于多巴胺能神經(jīng)元,可避免大量的多巴胺能神經(jīng)元在短期內(nèi)大量的死亡,能夠更好的的模擬臨床上帕金森病發(fā)病的病理過程,在10μM亞致死劑量的MPP+作用下,多巴胺神經(jīng)元突起的進(jìn)行性損傷較神經(jīng)元胞體損傷發(fā)生的更早且程度更為嚴(yán)重,這提示我們相較于胞體,神經(jīng)元突起對(duì)外界的損傷因素更為敏感并且其可能作為一種對(duì)外界刺激做出的主動(dòng)反應(yīng)參與了神經(jīng)元損傷的病理過程。第二部分:MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠軸突損傷的研究目的:應(yīng)用MPTP腹腔注射C57BL小鼠建立慢性帕金森模型。觀察在此過程中小鼠中腦部位多巴胺能神經(jīng)元胞體損傷的情況,及相應(yīng)的紋狀體投射部位的變化,探討多巴胺能神經(jīng)元軸突變性在帕金森病發(fā)病中的作用,同時(shí)進(jìn)一步明確多巴胺能神經(jīng)元胞體變性及軸突變性二者的關(guān)系。方法:大齡雄性C57BL小鼠110只,按照給藥次數(shù)的不同隨機(jī)分為11組(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10),每組10只。MPTP注射方法為腹腔注射30mg/kg,頻次為3天一次。MPTP注射后12h,相應(yīng)組別的小鼠被處死,行中腦及紋狀體部位組織TH染色及FJC染色,觀察TH染色陽性神經(jīng)元胞體及軸突的損傷及變性情況;同時(shí)行透射電鏡檢查觀察相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:第3次MPTP給藥后,小鼠開始出現(xiàn)步姿不協(xié)調(diào),行為緩慢等行為學(xué)改變,并且隨著給藥次數(shù)的增加而逐漸加重。TH染色結(jié)果示:正常對(duì)照組及第一次MPTP給藥組,在SNc及VTA區(qū)域均觀察到了TH-ir的細(xì)胞,其胞體飽滿,軸突長(zhǎng)且直,細(xì)胞排列整齊。第二次MPTP注射后,SNc部位的TH-ir細(xì)胞的突起開始變短變細(xì)并出現(xiàn)不規(guī)則的局部腫大,部分TH染色陽性軸突出現(xiàn)明顯的串珠樣改變,但其相對(duì)應(yīng)的神經(jīng)元胞體完整,形狀規(guī)則,形態(tài)學(xué)觀察未見明顯異常。隨著給藥次數(shù)的增加,軸突損傷的程度進(jìn)行性加重且出現(xiàn)胞體損傷。10次給藥后,SNc部位僅有少量TH-ir細(xì)胞,且其突起基本上全部消失。定量結(jié)果顯示紋狀體部位TH-ir纖維相對(duì)光密度值(OD)自第二次給藥后開始降低(P0.05)且隨給藥次數(shù)增加而進(jìn)行性加重,而黑質(zhì)致密部TH染色陽性細(xì)胞數(shù)量的下降則在發(fā)生時(shí)間上相對(duì)較晚,第四次MPTP注射后相較于對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。10次MPTP注射后,相對(duì)于對(duì)照組,紋狀體TH-ir纖維的OD值下降64%,同時(shí)SNc處TH-ir細(xì)胞數(shù)量下降47%。FJC染色示:第三次MPTP注射后在SNc處開始出現(xiàn)FJC-ir細(xì)胞,并且細(xì)胞數(shù)量隨給藥次數(shù)的增加而逐漸增多。FJC染色陽性神經(jīng)元細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出單一的胞體部分,而并未見明顯的神經(jīng)元突起,或僅殘留有少量的突起根部。透射電鏡示:在MPTP注射的早期,神經(jīng)元胞體的超微結(jié)構(gòu)并未出現(xiàn)明顯的變化,但是其對(duì)應(yīng)的軸突卻出現(xiàn)了較為明顯的超微結(jié)構(gòu)的改變:如軸突呈現(xiàn)不規(guī)則的腫脹,內(nèi)部的骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂甚至崩解消失等現(xiàn)象,并且隨MPTP腹腔注射次數(shù)的增加,相應(yīng)的軸突損傷的程度進(jìn)一步加重,直至出現(xiàn)軸突斷裂消失。結(jié)論:腹腔多次注射MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠帕金森模型中,TH染色陽性軸突損傷在發(fā)生時(shí)間上要遠(yuǎn)早于胞體的損傷,而在損傷程度上,軸突的損傷則更為嚴(yán)重,因此這就提示軸突損傷可能是其對(duì)外界因素的一種獨(dú)立反應(yīng),其在PD發(fā)病中的作用可能獨(dú)立于胞體損傷之外并發(fā)揮了重要作用。第三部分:MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元軸突變性機(jī)制的研究目的:利用MPP+作用于原代培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞及MPTP腹腔注射誘導(dǎo)的C57BL小鼠慢性帕金森模型,利用細(xì)胞骨架帶白β-TubulinⅢ的檢測(cè)進(jìn)一步定量軸突損傷,并揭示Akt/GSK-3β/CRMP-2信號(hào)通路是否參與了此過程,為PD的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。方法:通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析MPP+作用后,在不同時(shí)間點(diǎn)的Akt,GSK-3β及CRMP-2的表達(dá)及其磷酸化水平。應(yīng)用western blot及免疫熒光染色分析β-TubulinⅢ的表達(dá)水平。為進(jìn)一步明確Akt/GSK-3β/CRMP-2在軸突變性中的作用,在小鼠模型及體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元中應(yīng)用Akt的抑制劑LY294002,通過TH及FJC染色觀察其對(duì)MPTP及MPP+對(duì)軸突損傷的作用,并通過western blot分析進(jìn)一步分析Akt,GSK-3β及CRMP-2的表達(dá)及其磷酸化水平,應(yīng)用western blot及免疫熒光染色分析β-TubulinⅢ的表達(dá)水平。結(jié)果:在亞致死濃度MPP+(10μM)作用下,p-Akt和p-GSK-3β在作用1h后出現(xiàn)明顯下降,而在MPP+作用2小時(shí),其二者的表達(dá)水平開始逐漸增高并于4 h達(dá)到最高峰,然后在8h,12h和24h再次下降。而p-CRMP-2在給藥后1小時(shí)開始增加,2小時(shí)后下降并于4小時(shí)達(dá)到最低水平,8h,12h和24h較4h時(shí)表達(dá)升高但仍維持在較低水平。同時(shí),在整個(gè)過程中,我們發(fā)現(xiàn)總Ak,GSK-3β及CRMP-2無顯著變化。β-tubulin III在MPP+作用1小時(shí)后開始下降,且在整個(gè)24h的作用時(shí)間內(nèi)持續(xù)性降低。應(yīng)用Akt的阻斷劑LY294002后,經(jīng)過10次的MPTP和LY294002作用的C57BL小鼠其TH-ir神經(jīng)元數(shù)量相較于MPTP組下降了約27%,而紋狀體TH-ir纖維的OD值下降了35%。同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用LY294002和MPTP給藥十次后,SN部位的FJC-ir神經(jīng)元較MPTP處理組顯著增加(23%)。體外實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用LY294002及MPP+增加了多巴胺能神經(jīng)元軸突損傷的程度。作用4h后,和MPP+處理組相比,軸突的數(shù)量減少17%,而神經(jīng)元的數(shù)量和對(duì)照組及MPP+相比并沒有顯著的變化相比。作用24小時(shí)后,相較于MPP+處理組,神經(jīng)元的數(shù)量減少了22%,軸突的數(shù)量下降了15%。同時(shí)我們?cè)诼?lián)合應(yīng)用MPP+及LY294002 4h的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量了Akt,GSK-3β,CRMP-2及β-tubulin III的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn),作用4h后,LY294002可以使p-Akt及p-GSK3β表達(dá)下降,同時(shí)使p-CRMP-2的表達(dá)增高,β-tubulin III的表達(dá)下降。結(jié)論:Akt/GSK-3β/CRMP-2通路參與了MPTP或MPP+誘導(dǎo)的軸突損傷過程,尤其損傷初期,可能參與了β-tubulin III的降解,但隨著作用時(shí)間的增加,該通路進(jìn)一步激活可能為細(xì)胞本身對(duì)于損傷的一種保護(hù)作用。
[Abstract]:Parkinson ' s disease is a kind of degenerative disease of the central nervous system with high incidence of Parkinson ' s disease . In the control group , the number of apoptotic neurons in the neurons of the positive neurons decreased by 40 % in the early stage of MPP + and the number of apoptotic cells increased by 29 % . The results showed that the number of neurons increased gradually after 24 h of MPP + . In the second part , we observed the changes of dopaminergic neuron axon degeneration in the pathogenesis of Parkinson ' s disease . Conclusion : In the early stage , the expression of p - crMP - 2 and p - GSK3尾 can be decreased , and the expression of p - CRMP - 2 is increased , and the expression of 尾 - cyclodextrin III is decreased . Conclusion : The pathway is more likely to be involved in the degradation of 尾 - cyclodextrin III during the early stage of injury , but the activation of the pathway may be a protective effect of the cell itself on injury as the action time increases .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5;R-332
，

本文編號(hào)：1518371