發(fā)布時(shí)間：2018-02-11 16:57

  本文關(guān)鍵詞： 囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 囊泡單胺類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 核轉(zhuǎn)錄因子 神經(jīng)元 背根神經(jīng)節(jié) 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporters,VGLUTs)存在于囊泡膜上,能夠?qū)⑸窠?jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸囊泡內(nèi),并由此將神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放到突觸間隙而產(chǎn)生突觸后效應(yīng)。VGLUTs通過(guò)依賴(lài)氫離子濃度梯度來(lái)進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)的攝取與釋放。到目前為止,共有VGLUT1-3三種主要類(lèi)型的轉(zhuǎn)運(yùn)體被發(fā)現(xiàn),而第三種轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3分布相對(duì)局限,而且對(duì)其功能知之甚少。表達(dá)于神經(jīng)元的VGLUT3經(jīng)典的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是與其他神經(jīng)遞質(zhì),如5-輕色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)一同進(jìn)行協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn),而VGLUT3在5-羥色胺能神經(jīng)元所促成的谷氨酸信號(hào)可促進(jìn)5-HT的信息傳遞。單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT向突觸囊泡內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和由突觸前膜的釋放,有賴(lài)于囊泡單胺能轉(zhuǎn)運(yùn)體2(vesicular monoamine transporter 2,VMAT2)的正常表達(dá)和運(yùn)轉(zhuǎn)。VGLUT3和VMAT2在同一個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的共存現(xiàn)象進(jìn)一步揭示了不同神經(jīng)遞質(zhì)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。作為將周?chē)能|體感覺(jué)和內(nèi)臟感覺(jué)信息向中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)傳遞的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)初級(jí)傳入神經(jīng)元和將聽(tīng)覺(jué)信息向CNS傳遞的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuron,SGN),在處理不同的信息傳遞過(guò)程中均有賴(lài)于神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和釋放,而這一系列的過(guò)程又有賴(lài)于轉(zhuǎn)運(yùn)體的正常表達(dá)和運(yùn)轉(zhuǎn),而VGLUT3和VMAT2在DRG和SGN初級(jí)傳入神經(jīng)元的表達(dá)以及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全明確。作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin,NT)家族的重要成員之一,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。BDNF發(fā)揮生物學(xué)作用的過(guò)程是通過(guò)與其特異的高親和力酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)結(jié)合,進(jìn)而激活其下游的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂釀肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和磷脂酶 Cγ(phospholipase C gamma,PLCy)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。但是,BDNF是否對(duì)DRG和SGN初級(jí)傳入神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2的表達(dá)具有影響作用,目前尚不明確,BDNF對(duì)于神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究�；谝陨涎芯勘尘�,本課題分別應(yīng)用原代培養(yǎng)DRG和SGN神經(jīng)元,研究外源性BDNF對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3和VMAT2的表達(dá)調(diào)控作用及其機(jī)制,探討B(tài)DNF對(duì)VGLUT3和VMAT2的表達(dá)調(diào)控中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)、PI3K/Akt 和 PLCγ 三種信號(hào)通路所參與的作用,并進(jìn)一步用用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)進(jìn)行VGLUT3和VMAT2的干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)探究VGLUT3和VMAT2在BDNF引起的神經(jīng)突起生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制;為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5在促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)中的確切機(jī)制,本課題通過(guò)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)干擾Etv4和Etv5的表達(dá)或構(gòu)建Etv4和Etv5過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染DRG神經(jīng)元使Etv4和Etv5過(guò)表達(dá),來(lái)明確其在BDNF信號(hào)調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)過(guò)程中所發(fā)揮的作用。第一部分BDNF對(duì)DRG神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2表達(dá)的調(diào)控作用本課題利用原代培養(yǎng)的DRG初級(jí)傳入神經(jīng)元,研究了 BDNF及其相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路參與VGLUT3和VMAT2表達(dá)的調(diào)控作用,以及這種調(diào)控機(jī)制與神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,BDNF促進(jìn)DRG神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein 43,GAP-43)的表達(dá)呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。而且,BDNF能夠上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3的表達(dá),很可能是通過(guò)激活下游PLCγ信號(hào)通路起作用的。雖然BDNF沒(méi)有能夠上調(diào)VMAT2的表達(dá),但是在DRG神經(jīng)元中,在外源性BDNF作用下通過(guò)抑制PI3K或PLCγ信號(hào)通路可以抑制VMAT2的表達(dá),這一結(jié)果顯示,BDNF對(duì)VMAT2表達(dá)的調(diào)控作用不如對(duì)VGLUT3表達(dá)的調(diào)控作用明顯,但BDNF下游的相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路也可能介導(dǎo)了 VMAT2的表達(dá)。通過(guò)siRNA干擾VGLUT3和VMAT2的表達(dá)后,BDNF對(duì)突起生長(zhǎng)的促進(jìn)作用和GAP-43的表達(dá)上調(diào)并沒(méi)有受到顯著影響,BDNF對(duì)VGLUT3表達(dá)的獨(dú)特作用闡釋了在DRG初級(jí)傳入神經(jīng)元中外源性BDNF對(duì)谷氨酸信號(hào)傳入的調(diào)控可能存在不同的機(jī)制。BDNF引起的VGLUT3表達(dá)上調(diào)可能是BDNF調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的一個(gè)重要機(jī)制。BDNF信號(hào)在初級(jí)傳入神經(jīng)元中通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)體所介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng),對(duì)于解釋BDNF介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制增添了新的研究?jī)?nèi)容。第二部分BDNF通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3的表達(dá)和DRG神經(jīng)元的生長(zhǎng)本課題設(shè)計(jì)了以檢測(cè)和影響轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5表達(dá)為主線的實(shí)驗(yàn),探討了 BDNF及其相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)Etv4和Etv5表達(dá)的影響作用,通過(guò)特異性的siRNA干擾Etv4和Etv5的表達(dá)、通過(guò)轉(zhuǎn)染Etv4和Etv5過(guò)表達(dá)載體使Etv4和Etv5的表達(dá)水平上調(diào)的實(shí)驗(yàn)條件下,BDNF及其相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白中分子量神經(jīng)絲蛋白(medium neurofilament,NF-M)和輕分子量神經(jīng)絲蛋白(light neurofilament,NF-L)表達(dá)變化的影響,進(jìn)而分析在這種特有的實(shí)驗(yàn)條件下DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)或再生的機(jī)制,并在siRNA干擾Etv4和Etv5表達(dá)的條件下,在BDNF存在時(shí)VGLUT3和VMAT2的表達(dá)變化,試圖闡明轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5所介導(dǎo)的、在BDNF存在時(shí),DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)或再生的機(jī)制及其與VGLUT3和VMAT2表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,外源性BDNF孵育可顯著上調(diào)Etv4和Etv5及其mRNA的表達(dá)水平,BDNF上調(diào)Etv4和Etv5表達(dá)的效應(yīng)可能是通過(guò)激活其下游的ERK1/2信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的;Etv4siRNA或Etv5 siRNA可使BDNF孵育狀態(tài)下,生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達(dá)水平下調(diào),這與在同樣實(shí)驗(yàn)條件下DRG神經(jīng)元突起的縮短是一致的;過(guò)表達(dá)Etv4或Etv5可使BDNF孵育狀態(tài)下,生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達(dá)水平上調(diào),這與在同樣實(shí)驗(yàn)條件下DRG神經(jīng)元突起的延長(zhǎng)是一致的;Etv4 siRNA或Etv5 siRNA可阻止BDNF孵育狀態(tài)下VGLUT3表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì),而對(duì)VMAT2表達(dá)的影響作用不明顯。以上結(jié)果表明,BDNF可通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5的表達(dá)而誘發(fā)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá),并啟動(dòng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)蛋白NF-M、NF-L的表達(dá),在DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)或再生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,這可能是DRG神經(jīng)元突起生長(zhǎng)并發(fā)育成熟的重要機(jī)制;BDNF還可通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Etv4和Etv5的表達(dá)而使VGLUT3表達(dá)上調(diào),這可能是BDNF上調(diào)VGLUT3表達(dá)而增強(qiáng)興奮性氨基酸谷氨酸信息傳遞效能的重要機(jī)制之一,這與BDNF所介導(dǎo)的機(jī)械性痛覺(jué)信息傳遞或機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的作用是一致的。Etv4和Etv5作為初級(jí)傳入神經(jīng)元BDNF及其受體信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控神經(jīng)元突起生長(zhǎng)以及上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在神經(jīng)元突起生長(zhǎng)或再生中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用以及對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3表達(dá)的調(diào)控所產(chǎn)生的重要作用,不僅對(duì)于揭示以BDNF及其受體信號(hào)系統(tǒng)為主導(dǎo)的促神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的機(jī)制增添了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且對(duì)于其在以調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3表達(dá)為關(guān)鍵步驟的增強(qiáng)谷氨酸信號(hào)傳遞的機(jī)制方面提供了新的理論基礎(chǔ)。第三部分BDNF對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元VGLUT3和VMAT2的調(diào)控作用本課題應(yīng)用原代培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuron,SGN),研究外源性BDNF對(duì)于初級(jí)傳入SGN轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3和VMAT2表達(dá)的可能調(diào)控作用及其可能的機(jī)制,并探究這種調(diào)控機(jī)制與SGN存活和突起生長(zhǎng)的關(guān)系。結(jié)果顯示,外源性BDNF不僅可以通過(guò)激活其下游的PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)SGN中VGLUT3表達(dá)上調(diào)的作用,而且對(duì)SGN神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)和SGN神經(jīng)元存活具有促進(jìn)作用;在本實(shí)驗(yàn)的特定條件下,外源性BDNF尚不能調(diào)控SGN中的單胺類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體VMAT2的表達(dá);BDNF促進(jìn)SGN突起生長(zhǎng)和增加神經(jīng)元存活率與轉(zhuǎn)運(yùn)體VGLUT3和VMAT2表達(dá)模式之間的關(guān)系并不明顯,說(shuō)明BDNF對(duì)SGN的神經(jīng)生長(zhǎng)和存活的調(diào)控存在多種機(jī)制。外源性BDNF對(duì)SGN中VGLUT3表達(dá)的調(diào)控模式可能是SGN內(nèi)BDNF調(diào)控谷氨酸能信號(hào)傳遞的機(jī)制之一,而且BDNF對(duì)SGN神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)和SGN神經(jīng)元存活的促進(jìn)作用對(duì)于耳蝸正常功能的維持具有重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R338
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本文編號(hào)：1503545