本文關鍵詞： β-欖香烯 放射治療 乏氧 巨噬細胞 肺癌細胞　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指浸潤在腫瘤組織中的巨噬細胞,是腫瘤微環(huán)境中非常重要的細胞成分。研究發(fā)現(xiàn),放射和乏氧情況下腫瘤細胞對巨噬細胞的募集增多,即局部浸潤的TAM增多,且這些TAM多呈現(xiàn)出促腫瘤的表型,促進腫瘤細胞生存,血管生成,抑制腫瘤局部的免疫反應,這在一定程度上增加了腫瘤對放療的抵抗。因此研究放射和乏氧情況下巨噬細胞浸潤增多的原因,采用相應的治療方法抑制巨噬細胞浸潤,則可以增加腫瘤對放療的敏感性,改善治療效果。β-欖香烯(β-elemene)是從中藥溫郁金提取的化合物,具有放療增敏作用,目前研究發(fā)現(xiàn)其主要通過促進細胞凋亡、增強DNA損傷和抑制DNA修復等方面增強腫瘤細胞的放療敏感性。但其是否對腫瘤中巨噬細胞浸潤的過程有影響,還未見研究報道。放射可以激發(fā)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)過氧化物酶-1(Peroxiredoxin-1,Prx-1)等過氧化物酶的表達及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)等信號通路的活性,促進細胞存活。腫瘤乏氧是實體瘤中常見的現(xiàn)象,而放射會破壞腫瘤的血管結構,進一步加重腫瘤的乏氧。乏氧時低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表達增高,調(diào)控下游多個基因的轉(zhuǎn)錄,使細胞適應乏氧微環(huán)境。Prx-1、NF-κB、HIF-1α等信號通路和因子是否在巨噬細胞浸潤過程中發(fā)揮作用,尚不明確,有待進一步研究。因此,本研究觀察了放射和乏氧情況下,肺癌細胞對巨噬細胞浸潤的影響及β-欖香烯對此過程的作用,并對肺癌細胞募集巨噬細胞的機制進行了探討。旨在揭示放射和乏氧時巨噬細胞浸潤增多的原因,以便采取針對性的治療措施來抑制此過程,增加腫瘤的放療敏感性;同時也進一步明確了β-欖香烯的放療增敏機制,為其在臨床上的合理應用提供依據(jù)。目的:1.研究放射和乏氧情況下,β-欖香烯對肺癌細胞募集巨噬細胞的影響。2.研究放射和乏氧情況下,肺癌細胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表達及在肺癌細胞募集巨噬細胞過程中的作用,并進一步探討這些因子之間的調(diào)控關系。3.研究放射及β-欖香烯對小鼠肺癌移植瘤生長及巨噬細胞浸潤的影響,進一步驗證體外實驗結論。方法:第一部分:β-欖香烯對肺癌細胞募集巨噬細胞的影響1.MTT法檢測不同濃度β-欖香烯對小鼠Lewis肺癌細胞的生長抑制作用,計算24h的IC50,IC20和IC10。2.將Lewis細胞分為:(1)對照組:只接受DMEM培養(yǎng)基處理;(2)放射組:X線單次劑量4Gy照射;(3)藥物組:β-欖香烯45μg/ml作用24h;(4)藥物聯(lián)合放射組:45μg/mlβ-欖香烯作用24h后予4Gy單次劑量照射;(5)乏氧組:乏氧培養(yǎng)24h;(6)放射聯(lián)合乏氧組:X線單次劑量4Gy照射后,乏氧培養(yǎng)24h;(7)藥物聯(lián)合乏氧組:45μg/mlβ-欖香烯作用24h后,乏氧培養(yǎng)24h;(8)藥物、放射聯(lián)合乏氧組:45μg/mlβ-欖香烯作用24h后,X線單次劑量4Gy照射后,乏氧培養(yǎng)24h。收集各組細胞上清,即條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM),使用Transwell實驗檢測各組Lewis細胞對小鼠巨噬細胞RAW264.7的募集作用。3.實時定量PCR、ELISA實驗檢測Lewis細胞及上清中相關趨化因子m RNA和蛋白的表達。4.將趨化因子中和抗體加入對照組、放射組、乏氧組、放射聯(lián)合乏氧組上清后,Transwell實驗檢測Lewis細胞對RAW264.7細胞募集的變化情況。5.使用各組上清培養(yǎng)RAW264.7細胞,Western Blot、實時定量PCR實驗檢測巨噬細胞分型標志物的表達。第二部分:肺癌細胞Prx-1、NF-κB和HIF-1α的表達、相互調(diào)控及對巨噬細胞募集的影響1.Western Blot、實時定量PCR、免疫熒光實驗檢測放射和乏氧條件下,Lewis細胞中Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白及m RNA的表達。2.Lewis細胞分別轉(zhuǎn)染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA,在放射和乏氧條件下,收集上清,ELISA實驗檢測趨化因子的變化情況。3.提取細胞蛋白,Western Blot實驗檢測抑制一個基因表達后,其他兩個基因蛋白表達的變化情況。4.Lewis細胞分為:(1)對照組(2)放射組(3)藥物組(4)藥物聯(lián)合放射組(5)乏氧組(6)放射聯(lián)合乏氧組(7)藥物聯(lián)合乏氧組(8)藥物、放射聯(lián)合乏氧組。提取細胞蛋白,Western Blot檢測各組Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α蛋白表達。第三部分:放射及β-欖香烯對小鼠肺癌移植瘤生長及巨噬細胞浸潤的影響1.采用細胞懸液皮下接種法建立小鼠(C57BL/6)肺癌移植瘤模型并隨機分組(每組6只):對照組(Na Cl)、45mg/kgβ-欖香烯組、放射組(Na Cl+放射)、45mg/kgβ-欖香烯聯(lián)合放射組。2.隔日測量移植瘤的體積,繪制腫瘤生長曲線。3.末次處理后,觀察14d,切取腫瘤,拍照,稱瘤重,計算抑瘤率。4.移植瘤組織制作石蠟切片,免疫組化方法檢測巨噬細胞浸潤及趨化因子表達。結果:第一部分:1.β-欖香烯作用Lewis細胞24h的IC10、IC20、IC50分別為28.11μg/ml、43.75μg/ml和93.17μg/ml。2.與對照組相比,放射組、乏氧組和放射乏氧組的上清對RAW264.7細胞的趨化作用增強(P0.05),加入β-欖香烯后,各組這種增強的趨化作用被抑制(P0.05)。3.Lewis細胞中趨化因子MCP-1的m RNA表達在放射組、乏氧組和放射聯(lián)合乏氧組增高(P0.05),且可以被β-欖香烯抑制(P0.05)。ELISA實驗觀察到放射組、乏氧組和放射聯(lián)合乏氧組Lewis細胞MCP-1分泌增多(P0.05),加入β-欖香烯后,MCP-1分泌增多被抑制(P0.05)。4.將MCP-1中和抗體加入放射組、乏氧組和放射聯(lián)合乏氧組的上清進行孵育后,與對應未加中和抗體組相比,上清對RAW264.7細胞的趨化作用減弱(P0.05)。5.使用各組上清培養(yǎng)RAW264.7細胞后,放射組、放射聯(lián)合乏氧組的上清培養(yǎng)后的RAW264.7細胞,促腫瘤的M2表型標志因子ARG1蛋白表達及IL-10,MRC1m RNA表達增加(P0.05)。第二部分:1.放射和乏氧條件下,Lewis細胞Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1α的表達:1)放射組、放射聯(lián)合乏氧組Prx-1蛋白及m RNA表達增高(P0.05),乏氧組Prx-1蛋白及m RNA表達無變化(P0.05);2)放射組、乏氧組、放射聯(lián)合乏氧組NF-κB/p65入核增多,HIF-1α蛋白及m RNA表達增高(P0.05)。提示放射調(diào)控了Prx-1表達、NF-κB/p65入核和HIF-1α表達;而乏氧不調(diào)控Prx-1表達,只調(diào)控NF-κB/p65入核和HIF-1α表達。2.Lewis細胞轉(zhuǎn)染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,各組上清MCP-1表達的變化:1)轉(zhuǎn)染Prx-1 si RNA后,放射組、放射乏氧組MCP-1分泌不再增多,與各自未轉(zhuǎn)染組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),但乏氧組MCP-1分泌不受影響,仍增高(P0.05),提示抑制Prx-1表達影響放射誘導的MCP-1分泌,但不影響乏氧誘導的MCP-1分泌;2)轉(zhuǎn)染NF-κB/p65 si RNA后,放射組、乏氧組和放射乏氧組MCP-1分泌均不再增多,與各自未轉(zhuǎn)染組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明抑制NF-κB/p65表達影響放射和乏氧誘導的MCP-1分泌;3)轉(zhuǎn)染HIF-1α的si RNA后,放射組、乏氧組和放射乏氧組MCP-1分泌也不再增多,與各自未轉(zhuǎn)染組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),說明抑制HIF-1α表達影響放射和乏氧誘導的MCP-1分泌。3.Lewis細胞分別轉(zhuǎn)染Prx-1、NF-κB/p65和HIF-1αsi RNA后,其他兩個基因蛋白表達的變化:1)轉(zhuǎn)染Prx-1 si RNA后,放射組、放射聯(lián)合乏氧組的HIF-1α表達增高及NF-κB/p65入核增多被抑制(P0.05),提示放射后Prx-1調(diào)控了NF-κB/p65入核及HIF-1α表達;2)轉(zhuǎn)染NF-κB/p65 si RNA后,放射組、乏氧組、放射聯(lián)合乏氧組HIF-1α表達增高被抑制(P0.05);放射組、放射聯(lián)合乏氧組Prx-1表達不受影響(P0.05),仍增高。提示放射和乏氧后NF-κB/p65調(diào)控了HIF-1α的表達,但不調(diào)控Prx-1表達;3)轉(zhuǎn)染HIF-1αsi RNA后,放射組、乏氧組、放射聯(lián)合乏氧組NF-κB/p65入核不受影響(P0.05),仍增加;放射組、放射聯(lián)合乏氧組Prx-1表達也不受影響(P0.05),仍增高。提示放射和乏氧后HIF-1α不調(diào)控NF-κB/p65入核和Prx-1表達。4.已有實驗結果提示放射后Lewis細胞內(nèi)存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α上下游調(diào)控關系,TLR4是介導NF-κB通路激活的重要因子,因此將Lewis細胞轉(zhuǎn)染TLR4si RNA,抑制TLR4表達,放射誘導的NF-κB/p65入核增多被抑制(P0.05)。提示放射后Prx-1通過TLR4激活NF-κB。5.β-欖香烯抑制放射組、放射聯(lián)合乏氧組Prx-1表達增加、NF-κB/p65入核增加(P0.05);抑制放射組,乏氧組,放射聯(lián)合乏氧組HIF-1α表達增加(P0.05);但對乏氧組的NF-κB/p65入核增加沒有影響(P0.05)。第三部分:1.成功建立小鼠肺癌移植瘤模型,根據(jù)移植瘤體積獲得各組的生長曲線,治療第7天,各治療組移植瘤體積均小于對照組(P0.05);至第15天,β-欖香烯聯(lián)合放射組移植瘤體積明顯小于其他各組(P0.05);增敏系數(shù)(enhanced factor,EF)為1.65,提示該劑量β-欖香烯具有放療增敏作用。2.放射組、β-欖香烯組移植瘤重量小于對照組(P0.05),β-欖香烯聯(lián)合放射組移植瘤重量小于放射組和β-欖香烯組(P0.05),放射組、β-欖香烯組、β-欖香烯聯(lián)合放射組抑瘤率分別為:46.01%,36.81%和72.39%。3.與對照組相比,放射組巨噬細胞浸潤增多(P0.05),β-欖香烯組聯(lián)合放射巨噬細胞的浸潤少于放射組(P0.05)。4.與對照組相比,放射組MCP-1表達增多(P0.05),β-欖香烯聯(lián)合放射組MCP-1表達少于放射組(P0.05)。結論:第一部分:1.放射和乏氧促進肺癌細胞對巨噬細胞的募集,并且放射還可以促進巨噬細胞向促腫瘤M2表型轉(zhuǎn)化。2.放射和乏氧促進肺癌細胞分泌MCP-1。3.放射和乏氧促進的肺癌細胞對巨噬細胞的募集依賴于MCP-1。4.β-欖香烯抑制放射和乏氧促進的肺癌細胞對巨噬細胞的募集。5.β-欖香烯抑制放射和乏氧促進的肺癌細胞分泌MCP-1。第二部分:1.放射可以誘導肺癌細胞Prx-1表達、激活NF-κB、促進HIF-1α表達;乏氧對肺癌細胞Prx-1的表達無影響,但可以激活NF-κB和促進HIF-1α表達。2.放射誘導的MCP-1表達依賴于Prx-1、NF-κB、HIF-1α;但乏氧誘導的MCP-1表達不依賴于Prx-1,只依賴于NF-κB、HIF-1α。3.放射后肺癌細胞存在Prx-1/NF-κB/HIF-1α調(diào)節(jié)通路;乏氧后肺癌細胞存在NF-κB/HIF-1α調(diào)節(jié)通路。4.放射后Prx-1激活NF-κB依賴于TLR4。5.β-欖香烯抑制放射后肺癌細胞Prx-1表達、NF-κB激活及HIF-1α表達;β-欖香烯抑制乏氧后HIF-1α表達。第三部分:1.放射及β-欖香烯都可以抑制小鼠肺癌移植瘤的生長,聯(lián)合應用后抑制腫瘤效果更加明顯,β-欖香烯具有放射增敏作用。2.放射后小鼠肺癌移植瘤內(nèi)巨噬細胞浸潤增多,β-欖香烯抑制其浸潤增多。3.放射后小鼠肺癌移植瘤內(nèi)MCP-1表達增多,β-欖香烯抑制其表達增多。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：1502059