本文關(guān)鍵詞： 補(bǔ)腎法 卵母細(xì)胞質(zhì)量 線粒體功能 氧化應(yīng)激 抗氧化 Nrf2信號(hào)通路　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著不孕癥發(fā)病率逐年升高,體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技術(shù)成為治療不孕癥的重要手段�？刂菩月殉泊碳�(control ovarian stimulation,COS)是通過(guò)注射外源性促性腺激素調(diào)控卵巢內(nèi)多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育的干預(yù)過(guò)程,是IVF過(guò)程中關(guān)鍵步驟。單次移植的成功率很低,6個(gè)IVF-ET的累計(jì)活產(chǎn)率僅約65.3%,臨床上重復(fù)COS十分常見(jiàn)。受精卵由精卵結(jié)合而成,卵母細(xì)胞作為來(lái)源于母親的生殖細(xì)胞,具有傳遞遺傳物質(zhì),儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)能量的重要作用。重復(fù)COS后顆粒細(xì)胞線粒體功能下降已被證實(shí),影響線粒體功能的重要因素即氧化應(yīng)激狀態(tài)的存在。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞同處于卵泡中,線粒體作為卵母細(xì)胞胞質(zhì)中含量最為豐富的細(xì)胞器,為卵母細(xì)胞發(fā)育及早期胚胎發(fā)育提供能量,是評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的重要指標(biāo)。卵母細(xì)胞線粒體是否受到影響值得研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎法能夠調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞分泌因子表達(dá),提高卵母細(xì)胞質(zhì)量,并具有提高排卵障礙模型大鼠卵巢的抗氧化能力,降低氧化產(chǎn)物水平,改善卵巢功能的作用。本論文擬研究重復(fù)COS是否會(huì)造成卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài),觀察補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù)COS后卵母細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制,以期揭示補(bǔ)腎法通過(guò)改善氧化應(yīng)激狀態(tài),提高卵母細(xì)胞質(zhì)量,發(fā)揮調(diào)經(jīng)種子作用的可能機(jī)制,豐富“腎主生殖”的科學(xué)內(nèi)涵。第一部分補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù)COS小鼠卵巢抗氧化應(yīng)激能力的影響目的:研究重復(fù)COS對(duì)小鼠抗氧化酶活性、抗氧化能力的影響及是否對(duì)卵巢組織蛋白、脂質(zhì)及核酸成分造成氧化損傷,并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)重復(fù)COS后小鼠卵巢組織氧化損傷作用。方法:將40只8-10周齡雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,每天早9:00陰道涂片觀察動(dòng)情周期,隨機(jī)分為4組,補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、模型組及空白組,每組各10只。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組每日上午9:00分別灌胃蒸餾水及補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方,1m L/100g體重,連續(xù)10天。模型組及補(bǔ)腎各組于第11日同時(shí)腹腔注射PMSG 10IU/只,48小時(shí)后腹腔注射HCG10IU/只�？瞻捉M每日陰道涂片觀察動(dòng)情周期。重復(fù)以上過(guò)程3周期,每周期間隔4天。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組小鼠在COS第3周期注射PMSG后46h,擬注射HCG前脫頸椎處死,將兩側(cè)卵巢摘除,迅速凍于液氮中保存�？瞻捉M在觀察到發(fā)情期后10h脫頸椎處死,摘取卵巢,液氮凍存。使用時(shí)將卵巢由液氮中取出,置于冰上,加PBS勻漿,離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)8-OHd G、AOPP、MDA、SOD、GSH-Px及T-AOC的水平。結(jié)果:1各組卵巢組織8-OH-d G含量的比較與正常組比較,補(bǔ)腎高劑量組卵巢組織8-OHd G含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),補(bǔ)腎低劑量組8-OHd G含量升高(P0.05),模型組8-OHd G含量顯著升高(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高劑量組、正常組8-OHd G含量顯著降低(P0.01),補(bǔ)腎低劑量組8-OHd G含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較,補(bǔ)腎高劑量組8-OHd G更低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2各組卵巢組織AOPP含量的比較與正常組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織AOPP含量升高(P0.05),模型組AOPP含量顯著升高(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組AOPP含量顯著降低(P0.01),正常組AOPP含量顯著降低(P0.01)。補(bǔ)腎高低劑量組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3各組卵巢組織MDA含量的比較補(bǔ)腎高、低劑量組與正常組卵巢組織MDA含量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組MDA含量明顯高于正常組(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組MDA含量明顯降低(P0.01);補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4各組卵巢組織SOD活力的比較補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織SOD活力與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組SOD活力較正常組明顯降低(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組SOD活力明顯升高(P0.01);且補(bǔ)腎高、低劑量組SOD活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),補(bǔ)腎高劑量組SOD活力更高。5各組卵巢組織GSH-Px活力的比較補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織GSH-Px活力與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組GSH-Px活力較正常組顯著降低(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組GSH-Px活力顯著增高(P0.01);補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6各組卵巢組織T-AOC比較補(bǔ)腎高低劑量組卵巢組織T-AOC水平與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組T-AOC較正常組顯著降低(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組T-AOC增高(P0.05)。補(bǔ)腎高低劑量組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小結(jié):1重復(fù)COS會(huì)提高小鼠卵巢組織核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷水平,影響小鼠卵巢中抗氧化酶的活性,造成小鼠卵巢組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。2補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠降低重復(fù)COS小鼠卵巢組織的核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷標(biāo)志物水平,提高小鼠卵巢組織抗氧化酶的活性,有助于消除重復(fù)COS對(duì)小鼠卵巢組織造成的氧化應(yīng)激狀態(tài),糾正卵巢氧化/抗氧化失衡,調(diào)節(jié)機(jī)體至“陰平陽(yáng)秘”狀態(tài)。3重復(fù)COS可能通過(guò)影響卵巢組織氧化應(yīng)激狀態(tài)進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育,降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過(guò)糾正卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài),以改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。第二部分補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù)COS小鼠卵母細(xì)胞線粒體功能的影響目的:研究重復(fù)COS對(duì)小鼠卵母細(xì)胞ROS量及線粒體功能的影響,并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)重復(fù)COS小鼠卵母細(xì)胞線粒體功能的作用。方法:將48只8-10周齡健康清潔級(jí)雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后,每天早9:00陰道涂片觀察動(dòng)情周期,隨機(jī)分為4組,補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、模型組及空白組,每組各12只。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組每日上午9:00分別灌胃蒸餾水及補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方,1m L/100g體重,連續(xù)10天。模型組及補(bǔ)腎各組于第11日同時(shí)腹腔注射PMSG 10IU/只,48小時(shí)后腹腔注射h CG 10IU/只。空白組每日陰道圖片觀察動(dòng)情周期。重復(fù)以上過(guò)程3周期,每周期間隔4天。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組小鼠在超促排卵第3周期注射HCG后14-16h,空白組于觀察到動(dòng)情期后12h,脫頸椎處死小鼠,剪開(kāi)腹壁,充分暴露后取出輸卵管,在PBS中清洗去血液,將輸卵管置于M16培養(yǎng)液中,用1m L注射器針頭劃破輸卵管膨大處,卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)溢出,透明質(zhì)酸酶消化,去除顆粒細(xì)胞后收集于無(wú)菌Ep管中,一部分液氮凍存檢測(cè)ROS水平;一部分立即送染色,激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體功能。采用DCFH-DA染色,共聚焦顯微鏡觀察ROS水平;采用Mito Tracker Red染色,共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞線粒體分布;采用熒光素酶法檢測(cè)卵母細(xì)胞ATP量;采用JC-1染色,共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞膜電位(MMP);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵母細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)。結(jié)果:1各組卵母細(xì)胞ROS水平的比較與正常組卵母細(xì)胞ROS水平比較,補(bǔ)腎高、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組卵母細(xì)胞ROS水平較正常組顯著升高(P0.01);與模型組卵母細(xì)胞ROS水平比較,補(bǔ)腎高、低劑量組均降低,其中補(bǔ)腎高劑量組降低顯著(P0.01);補(bǔ)腎高、低劑量組間比較,高劑量組ROS水平較低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2各組卵母細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)比較與正常組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組mt DNA拷貝數(shù)較正常組顯著降低(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎高劑量組mt DNA明顯升高(P0.01),補(bǔ)腎低劑量組及正常組mt DNA升高(P0.05);補(bǔ)腎高低劑量組之間比較,卵母細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3各組卵母細(xì)胞ATP含量比較與正常組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞ATP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組ATP含量較正常組下降(P0.05);與模型組比較,補(bǔ)腎高劑量組ATP含量升高明顯(P0.01),補(bǔ)腎低劑量組及正常組ATP含量升高(P0.05);補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4各組卵母細(xì)胞MMP強(qiáng)度的比較與正常組比較,補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞MMP平均強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),模型組MMP平均強(qiáng)度較正常組明顯降低,(P0.01);與模型組比較,補(bǔ)腎低劑量組MMP強(qiáng)度升高(P0.05),補(bǔ)腎高劑量組及正常組MMP平均強(qiáng)度明顯增高,差異具有顯著性(P0.01);補(bǔ)腎高劑量組MMP平均強(qiáng)度高于低劑量組(P0.05)。5各組卵母細(xì)胞線粒體分布補(bǔ)腎高/低劑量組、模型組及正常組卵母細(xì)胞線粒體均勻分布的比率分別為79.2%,73.9%,69%及80.9%。卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示,補(bǔ)腎高/低劑量組及正常組線粒體均勻分布比率均高于模型組,但四組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。小結(jié):1重復(fù)COS會(huì)影響卵母細(xì)胞ROS水平、線粒體mt DNA拷貝數(shù)及MMP強(qiáng)度,影響卵母細(xì)胞ATP的水平,降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。2補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠降低重復(fù)COS后卵母細(xì)胞ROS水平,提高重復(fù)COS后卵母細(xì)胞線粒體mt DNA拷貝數(shù)、MMP強(qiáng)度及其ATP水平,改善重復(fù)COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量,且高劑量補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方改善線粒體MMP強(qiáng)度的效果更優(yōu)。3補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠提高重復(fù)COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量與其改善卵母細(xì)胞線粒體功能有關(guān),可作為治療臨床重復(fù)COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的輔助用藥。第三部分體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及補(bǔ)腎法對(duì)體外培養(yǎng)氧化應(yīng)激狀態(tài)卵母細(xì)胞ROS水平及PB1排出率的影響目的:研究體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,添加氧化劑H_2O_2對(duì)卵母細(xì)胞ROS水平及PB1排出率的影響,并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)上述指標(biāo)的影響。方法:選用8只6-7周齡健康雌性SD大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)后每日灌胃補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方2次,1m L/200g體重(相當(dāng)于臨床等效劑量),連續(xù)3天。于第4日禁食12h后,一次性灌服全天劑量。給藥1h后水合氯醛腹腔注射麻醉,股動(dòng)脈取血。室溫靜置2h后離心,留取血清,56℃水浴30min滅活補(bǔ)體,0.22μm無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌,得到補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清,-80℃保存?zhèn)溆�。選用15只24-26日齡小鼠每只注射PMSG 5IU促排卵,44h后脫頸椎法處死小鼠。消毒后分離完整卵巢,清洗去除血液及多余組織,置于預(yù)熱的M2培養(yǎng)液中,體視顯微鏡下使用注射器針輕柔撕裂卵巢組織,挑破較大有腔卵泡,選擇大小均一、包裹3-5層卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs),清洗后移入35mm培養(yǎng)皿中,添加2m L IVM培養(yǎng)液(α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS+100m IU/m L r FSH+1.5 U/m Lh CG+3ng/m L EGF+100IU/rn L青霉素+100μg/m L鏈霉素)。培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為3組分別培養(yǎng)。(1)正常組:IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)至14-16h;(2)補(bǔ)腎組:IVM培養(yǎng)液添加10%補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清培養(yǎng)2h,再給予H_2O_2,繼續(xù)培養(yǎng)至14-16h;(3)H_2O_2組:IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)2h,添加100μM濃度H_2O_2,培養(yǎng)至14-16h。倒置顯微鏡觀察COCs發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化。將COCs置于吹打消化,脫去顆粒細(xì)胞后倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)PB1排出率。DCFH-DA染料染色,共聚焦顯微鏡觀察ROS水平。結(jié)果:1卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物在IVM培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化GV期COCs中,卵母細(xì)胞可見(jiàn)透明帶,卵母細(xì)胞周圍可見(jiàn)多層、致密卵丘細(xì)胞包裹。IVM 16-18h后,COCs體積增大,卵丘擴(kuò)張生長(zhǎng)并且結(jié)構(gòu)松散,中間可見(jiàn)卵母細(xì)胞輪廓。100U/m L透明質(zhì)酸酶消化培養(yǎng)后的COCs,移液器吹打消化,MⅠ期卵母細(xì)胞無(wú)第一極體排出,MⅡ期卵母細(xì)胞可見(jiàn)明顯卵周間隙,卵周間隙可見(jiàn)第一極體。2各組間卵母細(xì)胞ROS水平比較與正常組比較,補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組ROS水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),H_2O_2組較正常組ROS水平顯著升高(P0.01);補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與H_2O_2組比較,卵母細(xì)胞ROS水平顯著降低(P0.01)。3各組間卵母細(xì)胞PB1排出率的比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與正常組比較,卵母細(xì)胞PB1排出率補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),H_2O_2組卵母細(xì)胞PB1排出率較正常組顯著降低(P0.01);補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組與H_2O_2組比較,卵母細(xì)胞PB1排出率顯著增高(P0.01)。小結(jié):1在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加H_2O_2可引起卵母細(xì)胞中ROS增加,PB1排出率降低,造成卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。2體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可降低H_2O_2引起的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的堆積,提高卵母細(xì)胞PB1排出率,提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方具有改善卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài),提高卵母細(xì)胞成熟率的作用。第四部分補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激初期Nrf2抗氧化應(yīng)激通路的影響目的:研究體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激初期對(duì)Nrf2信號(hào)通路及下游抗氧化酶的影響,及添加補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清培養(yǎng)對(duì)氧化應(yīng)激初期卵母細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路及下游抗氧化酶的影響。方法:選用24只6-7周齡健康雌性SD大鼠,制備補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清,方法同第三部分。選用60只24-26日齡昆明小鼠,機(jī)械法分離GV期卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物,方法同第三部分。將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為3組分別培養(yǎng)。(1)正常組:IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)6小時(shí);(2)補(bǔ)腎組:IVM培養(yǎng)液添加10%補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清培養(yǎng)4h,再給予H_2O_2,繼續(xù)培養(yǎng)至6h;(3)H_2O_2組:IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)4h,添加100μM濃度H_2O_2,培養(yǎng)至6h。收集COCs,100U/m L透明質(zhì)酸酶中,吹打消化,脫去顆粒細(xì)胞,收集后一部分立即行免疫熒光檢測(cè);一部分-80℃凍存用于RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果:1各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中PKC、Keap1、Nrf2、SOD、GSH-PxmRNA的比較1.1各組卵母細(xì)胞中PKC、Keap1、Nrf2 mRNA含量的比較PKC mRNA表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組PKC mRNA表達(dá)均顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組PKC mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01)。Keap1 mRNA表達(dá):正常組、H_2O_2組及補(bǔ)腎組之間Keap1 mRNA表達(dá)比較,差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Nrf2 mRNA表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組Nrf2 mRNA表達(dá)升高(P0.05)。1.2各組卵母細(xì)胞中Mn SOD及GSH-Px mRNA含量的比較Mn SOD mRNA表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組Mn SOD mRNA表達(dá)升高(P0.05),補(bǔ)腎組表達(dá)顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組Mn SOD mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01)。GSH-Px mRNA表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組GSH-Px mRNA表達(dá)均顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組GSH-Px mRNA表達(dá)顯著升高(P0.01)。2各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中PKC、p-PKC、Keap1、Nrf2、p-Nrf2蛋白表達(dá)的比較PKC蛋白表達(dá):各組之間卵母細(xì)胞中PKC蛋白表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);p-PKC蛋白表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組p-PKC蛋白表達(dá)升高(P0.05),補(bǔ)腎組表達(dá)顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組p-PKC蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。p-PKC/PKC表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組升高(P0.05),補(bǔ)腎組顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組顯著升高(P0.01)。Keap1蛋白表達(dá):各組之間卵母細(xì)胞中Keap1蛋白表達(dá)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Nrf2蛋白表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組Nrf2蛋白表達(dá)均升高(P0.05);H_2O_2組與補(bǔ)腎組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。p-Nrf2蛋白表達(dá):與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。p-Nrf2/Nrf2比值:與正常組比較,H_2O_2組及補(bǔ)腎組p-Nrf2/Nrf2比值顯著升高(P0.01);與H_2O_2組比較,補(bǔ)腎組p-Nrf2/Nrf2顯著升高(P0.01)。小結(jié):1氧化應(yīng)激可激活Nrf2信號(hào)通路,引起Nrf2 mRNA表達(dá)增加,及其下游抗氧化酶Mn SOD、GSH-Px的基因轉(zhuǎn)錄。2氧化應(yīng)激初期Nrf2蛋白活性升高與Keap1表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)系,可能與PKC提高Nrf2磷酸化水平,使其自Keap1解離有關(guān)。3補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠減少氧化應(yīng)激后卵母細(xì)胞ROS水平,其機(jī)制可能與其調(diào)控氧化應(yīng)激初期PKC-Nrf2信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),提高下游抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。結(jié)論:重復(fù)控制性卵巢刺激會(huì)引起卵巢抗氧化能力下降,抗氧化酶活性降低,氧化損傷產(chǎn)物增多,并影響卵母細(xì)胞線粒體功能,降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。補(bǔ)腎法能夠改善重復(fù)COS后卵巢抗氧化能力,提高抗氧化酶活性,減少卵巢氧化損傷,并能夠改善卵母細(xì)胞線粒體功能,其機(jī)制可能是通過(guò)使卵母細(xì)胞內(nèi)PKC表達(dá)升高,激活Nrf2基因轉(zhuǎn)錄,提高Nrf2蛋白活性,誘導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路下游抗氧化酶基因表達(dá),提高卵母細(xì)胞抗氧化能力,發(fā)揮其改善卵母細(xì)胞質(zhì)量的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R711.6

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本文編號(hào)：1487921