發(fā)布時(shí)間：2018-01-23 02:09

  本文關(guān)鍵詞： 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 帕金森病 α-突觸核蛋白 tau蛋白 6-羥基多巴胺 磷酸化 PI3K/AKT/GSK-3信號(hào)通路 鼻腔給藥 脂質(zhì)體 CK-1 DCX　出處：《暨南大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森(Parkinson’s disease,PD)模型中的作用,并探討其作用機(jī)制。同時(shí)對(duì)b FGF的藥代動(dòng)力學(xué)和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),為帕金森的臨床治療提供理論依據(jù),也為b FGF提供安全有效的給藥途徑。方法:(1)利用腦立體定位系統(tǒng)將6-OHDA注射到SD大鼠紋狀體進(jìn)行造模,同時(shí)采用脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)和經(jīng)鼻給藥的方式將b FGF遞送入腦。(2)行為學(xué)(旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),步態(tài)分析實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn))檢測(cè)b FGF和脂質(zhì)體b FGF對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型的作用。(3)電化學(xué)高校液相色譜法(HPLC-ECD)檢測(cè)大鼠紋狀體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA濃度。(4)免疫組化法和免疫印跡法檢測(cè)紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)。(5)尼氏染色法觀(guān)察尼氏小體。(6)核磁共振掃描成像分析大鼠受損側(cè)紋狀體感興趣區(qū)FA,ADC,MD,T2,R2,CBF,MK,KR和KA值。(7)免疫印跡法檢測(cè)大鼠受損側(cè)黑質(zhì)內(nèi)PD相關(guān)蛋白的表達(dá)。(8)ELISA法測(cè)定大鼠血清中b FGF濃度。(9)ELISA法和免疫印跡法共同檢測(cè)大鼠嗅球,大腦皮質(zhì),紋狀體,海馬和黑質(zhì)內(nèi)b FGF濃度。(10)HE染色觀(guān)察大鼠嗅球,鼻黏膜,黑質(zhì),紋狀體,肝臟和肺的病理學(xué)變化。(11)MTT法測(cè)不同濃度的6-OHDA和b FGF對(duì)細(xì)胞活存活率的影響。(12)掃描電鏡觀(guān)察6-OHDA和b FGF處理后的細(xì)胞形態(tài)。(13)免疫印跡法檢測(cè)PD相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后30 min能夠分布于大鼠嗅球,大腦皮質(zhì),紋狀體和黑質(zhì)(p0.05);b FGF鼻腔給藥后30 min分布于大鼠嗅球,大腦皮質(zhì)和紋狀體內(nèi)(p0.05);兩給藥組相比,脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后在大腦皮質(zhì)和紋狀體內(nèi)的含量明顯多于b FGF單獨(dú)給藥組(p0.05)。ELISA結(jié)果與western結(jié)果基本一致。(2)6-OHDA損傷4周后,大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)達(dá)到6r/min,被視為成功模型。(3)6-OHDA注射后造成動(dòng)物行為障礙,包括:旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增加,步態(tài)紊亂,步幅減小,活動(dòng)減少,活動(dòng)頻率降低等(p0.05)。脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后能夠顯著減少阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),增加曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)距離,運(yùn)動(dòng)頻率,延長(zhǎng)了步幅,減少了通過(guò)時(shí)間等(p0.05),這些行為學(xué)的改善作用效果明顯強(qiáng)于b FGF給藥組;而空載脂質(zhì)體組對(duì)PD大鼠的行為學(xué)并無(wú)影響。(4)6-OHDA很大程度上減少了紋狀體內(nèi)DA,DOPAC和HVA的濃度(91.2%,84.3%,92.3%)(p0.05);與模型組相比,脂質(zhì)體b FGF對(duì)DA的增加具有劑量依賴(lài)性(11%,15.4%,25.9%),脂質(zhì)體b FGF對(duì)HVA和DOPAC的上調(diào)作用與DA基本一致。b FGF給藥組也增加了DA和DOPAC的濃度,但對(duì)HVA的濃度幾乎沒(méi)有影響。(5)TH陽(yáng)性神經(jīng)元在受損側(cè)紋狀體和黑質(zhì)內(nèi)的表達(dá)量?jī)H為18%和22%(p0.05),極大程度上損傷了神經(jīng)元。與模型組相比,150μg/kg和300μg/kg兩個(gè)劑量的脂質(zhì)體b FGF給藥后,TH陽(yáng)性神經(jīng)元的含量在紋狀體內(nèi)分別被提高了15%和23%(p0.05),而在黑質(zhì)內(nèi)分別上調(diào)了20%和25%(p0.05)。600μg/kg的脂質(zhì)體b FGF和300μg/kg的b FGF在黑質(zhì)紋狀體內(nèi)對(duì)神經(jīng)元的上調(diào)作用并不明顯。相同劑量條件下,脂質(zhì)體b FGF對(duì)神經(jīng)元的促進(jìn)作用要明顯高于b FGF溶液組。免疫印跡結(jié)果與免疫組化結(jié)果基本保持一致。(6)6-OHDA在紋狀體內(nèi)使尼氏小體的數(shù)目減少了約80%(p0.05),脂質(zhì)體b FGF低、中兩個(gè)劑量組顯著增加了尼氏小體數(shù)目(p0.05),組間相比,中劑量組的這種效果最為明顯;與模型組相比,b FGF對(duì)尼氏小體的數(shù)目基本沒(méi)有增加。(7)受損側(cè)紋狀體感興趣區(qū)的FA值明顯上調(diào)(p0.05),而MD值卻被下調(diào)(p0.05),ADC在6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型中并無(wú)顯著改變;空白組雙側(cè)FA、MD和ADC之間無(wú)差異;脂質(zhì)體b FGF和b FGF給藥組對(duì)這3個(gè)參數(shù)值均無(wú)影響。6-OHDA能夠顯著上調(diào)橫向質(zhì)子弛豫率(p0.05),并降低橫向質(zhì)子弛豫時(shí)間(p0.05),中劑量的脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后下調(diào)了橫向質(zhì)子弛豫率,升高了橫向質(zhì)子弛豫時(shí)間(p0.05),這兩種作用與低劑量之間有顯著性差異。另外,6-OHDA能夠?qū)е履X血流量的減少(p0.05),150μg/kg和600μg/kg兩個(gè)劑量的脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后顯著上升了受損側(cè)紋狀體內(nèi)感興趣區(qū)的血流量(p0.05);組間相比,150μg/kg的脂質(zhì)體b FGF組對(duì)血流量的增加作用效果更好(p0.05)。(8)6-OHDA能夠減少微管蛋白的表達(dá),增加大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-syn Ser129位點(diǎn)和tau Ser 396位點(diǎn)的磷酸化,上調(diào)CK-1,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);而脂質(zhì)體b FGF鼻腔給藥后,能夠增加微管蛋白和DCX的表達(dá),降低大鼠黑質(zhì)內(nèi)α-syn Ser129位點(diǎn)和tau Ser 396位點(diǎn)的磷酸化,下調(diào)CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信號(hào)通路(p0.05);6-OHDA和b FGF對(duì)大鼠黑質(zhì)內(nèi)DJ-1,Parkin,PINK和Synapsin均沒(méi)有顯著的調(diào)控作用。(9)脂質(zhì)體b FGF和b FGF經(jīng)鼻腔給藥后,在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)符合二室開(kāi)放模型,加權(quán)為1。150μg/kg,300μg/kg和600μg/kg的脂質(zhì)體b FGF與300μg/kg的b FGF鼻腔給藥后的消除半衰期分別為174.5±29.2min,207.4±73.6min,260.6±41.6min,60.7±16.9min;藥時(shí)曲線(xiàn)下面積分別為672.6±86.6μg/L*min,1324.9±175.3μg/L*min,2191.8±256.3μg/L*min,700.1±122.3μg/L*min。(10)45mg/kg的脂質(zhì)體b FGF和b FGF靜脈注射后,小鼠無(wú)一例死亡,且生活狀態(tài)良好,雄性小鼠兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組體重呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài),與空白對(duì)照組相比,均無(wú)顯著性差異(P0.05);而雌性小鼠b FGF給藥組的體重在給藥后的第一周幾乎沒(méi)有增加,在第二周過(guò)后又恢復(fù)正常。(11)各臟器HE染色結(jié)果與空白組相比,均未見(jiàn)有顯著意義的病理學(xué)改變。(12)6-OHDA處理后,細(xì)胞的存活率降低,50~100μM的6-OHDA對(duì)細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響,150,200,250和300μM的6-OHDA誘導(dǎo)后,細(xì)胞的存活率分別為16%,40%,52%和61%,100 ng/ml,500 ng/ml和1000 ng/ml的b FGF預(yù)處理組細(xì)胞存活率明顯上調(diào)。(13)超微水平觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué),200μM的6-OHDA能夠損傷SH-SY5Y細(xì)胞,使其嚴(yán)重變形,破裂,細(xì)胞質(zhì)外泄,軸突變短,而b FGF預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞則能夠?qū)?-OHDA所產(chǎn)生的毒性,改善細(xì)胞的形態(tài),維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。(14)6-OHDA能夠減少微管蛋白和突觸蛋白的表達(dá),上調(diào)CK-1和PLK-2,增加SY-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-syn Ser129位點(diǎn)和tau Ser 396位點(diǎn)的磷酸化,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);b FGF能夠增加tubulin,α-syn和DCX的表達(dá),降低SY-SY5Y細(xì)胞內(nèi)α-syn Ser129位點(diǎn)和tau Ser 396位點(diǎn)的磷酸化,下調(diào)CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信號(hào)通路(p0.05)。結(jié)論:(1)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明,b FGF在6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用。(2)b FGF通過(guò)下調(diào)α-syn Ser129位點(diǎn)磷酸化和tau蛋白Ser 396位點(diǎn)的磷酸化來(lái)減少6-OHDA引起的神經(jīng)毒性。(3)b FGF通過(guò)下調(diào)CK-1的表達(dá)從而減少α-syn Ser129位點(diǎn)磷酸化;b FGF通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK-3信號(hào)通路來(lái)調(diào)控tau蛋白Ser 396位點(diǎn)的磷酸化。(4)脂質(zhì)體能夠幫助b FGF延長(zhǎng)半衰期,使其消除速率減慢;同時(shí)增加b FGF在大腦皮質(zhì)和紋狀體內(nèi)的分布。(5)脂質(zhì)體b FGF和b FGF對(duì)小鼠的最大耐受劑量大于45mg/kg,且對(duì)大鼠鼻黏膜,嗅球,黑質(zhì)紋狀體,肝臟和肺均無(wú)病理學(xué)的損傷作用。
[Abstract]:Objective: To study the effect of basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, B FGF) in 6- (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) of 6-hydroxydopamine induced Parkinson (Parkinson 's disease, PD) model in rats, and explore its mechanism. At the same time to evaluate the pharmacokinetics and safety of B FGF, provide the theoretical basis for the clinical treatment of Parkinson, the route of Administration for the B FGF to provide safe and effective. Methods: (1) by stereotaxic system 6-OHDA was injected into the striatum of SD rat model was made by liposome and intranasal administration of B FGF (delivered into the brain. 2) behavior (rotation experiment, gait analysis experiment and field test was used to detect the effect of B FGF) and B FGF liposome on PD model induced by 6-OHDA. (3) the electrochemical liquid chromatography (HPLC-ECD) detection in the rat striatum neurotransmitters DA and its metabolic products 鐗〥OPAC鍜孒VA嫻撳害.(4)鍏嶇柅緇勫寲娉曞拰鍏嶇柅鍗拌抗娉曟嫻嬬汗鐘朵綋鍜岄粦璐ㄥ唴TH鐨勮〃杈，

本文編號(hào)：1456393