本文關鍵詞： 堿性成纖維細胞生長因子 帕金森病 α-突觸核蛋白 tau蛋白 6-羥基多巴胺 磷酸化 PI3K/AKT/GSK-3信號通路 鼻腔給藥 脂質體 CK-1 DCX　出處：《暨南大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:研究堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導的帕金森(Parkinson’s disease,PD)模型中的作用,并探討其作用機制。同時對b FGF的藥代動力學和安全性進行評價,為帕金森的臨床治療提供理論依據,也為b FGF提供安全有效的給藥途徑。方法:(1)利用腦立體定位系統(tǒng)將6-OHDA注射到SD大鼠紋狀體進行造模,同時采用脂質體載藥系統(tǒng)和經鼻給藥的方式將b FGF遞送入腦。(2)行為學(旋轉實驗,步態(tài)分析實驗和曠場實驗)檢測b FGF和脂質體b FGF對6-OHDA誘導的PD模型的作用。(3)電化學高校液相色譜法(HPLC-ECD)檢測大鼠紋狀體內神經遞質DA及其代謝產物DOPAC和HVA濃度。(4)免疫組化法和免疫印跡法檢測紋狀體和黑質內TH的表達。(5)尼氏染色法觀察尼氏小體。(6)核磁共振掃描成像分析大鼠受損側紋狀體感興趣區(qū)FA,ADC,MD,T2,R2,CBF,MK,KR和KA值。(7)免疫印跡法檢測大鼠受損側黑質內PD相關蛋白的表達。(8)ELISA法測定大鼠血清中b FGF濃度。(9)ELISA法和免疫印跡法共同檢測大鼠嗅球,大腦皮質,紋狀體,海馬和黑質內b FGF濃度。(10)HE染色觀察大鼠嗅球,鼻黏膜,黑質,紋狀體,肝臟和肺的病理學變化。(11)MTT法測不同濃度的6-OHDA和b FGF對細胞活存活率的影響。(12)掃描電鏡觀察6-OHDA和b FGF處理后的細胞形態(tài)。(13)免疫印跡法檢測PD相關蛋白的表達。結果:(1)脂質體b FGF鼻腔給藥后30 min能夠分布于大鼠嗅球,大腦皮質,紋狀體和黑質(p0.05);b FGF鼻腔給藥后30 min分布于大鼠嗅球,大腦皮質和紋狀體內(p0.05);兩給藥組相比,脂質體b FGF鼻腔給藥后在大腦皮質和紋狀體內的含量明顯多于b FGF單獨給藥組(p0.05)。ELISA結果與western結果基本一致。(2)6-OHDA損傷4周后,大鼠旋轉圈數(shù)達到6r/min,被視為成功模型。(3)6-OHDA注射后造成動物行為障礙,包括:旋轉圈數(shù)增加,步態(tài)紊亂,步幅減小,活動減少,活動頻率降低等(p0.05)。脂質體b FGF鼻腔給藥后能夠顯著減少阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)誘導的旋轉圈數(shù),增加曠場中的運動距離,運動頻率,延長了步幅,減少了通過時間等(p0.05),這些行為學的改善作用效果明顯強于b FGF給藥組;而空載脂質體組對PD大鼠的行為學并無影響。(4)6-OHDA很大程度上減少了紋狀體內DA,DOPAC和HVA的濃度(91.2%,84.3%,92.3%)(p0.05);與模型組相比,脂質體b FGF對DA的增加具有劑量依賴性(11%,15.4%,25.9%),脂質體b FGF對HVA和DOPAC的上調作用與DA基本一致。b FGF給藥組也增加了DA和DOPAC的濃度,但對HVA的濃度幾乎沒有影響。(5)TH陽性神經元在受損側紋狀體和黑質內的表達量僅為18%和22%(p0.05),極大程度上損傷了神經元。與模型組相比,150μg/kg和300μg/kg兩個劑量的脂質體b FGF給藥后,TH陽性神經元的含量在紋狀體內分別被提高了15%和23%(p0.05),而在黑質內分別上調了20%和25%(p0.05)。600μg/kg的脂質體b FGF和300μg/kg的b FGF在黑質紋狀體內對神經元的上調作用并不明顯。相同劑量條件下,脂質體b FGF對神經元的促進作用要明顯高于b FGF溶液組。免疫印跡結果與免疫組化結果基本保持一致。(6)6-OHDA在紋狀體內使尼氏小體的數(shù)目減少了約80%(p0.05),脂質體b FGF低、中兩個劑量組顯著增加了尼氏小體數(shù)目(p0.05),組間相比,中劑量組的這種效果最為明顯;與模型組相比,b FGF對尼氏小體的數(shù)目基本沒有增加。(7)受損側紋狀體感興趣區(qū)的FA值明顯上調(p0.05),而MD值卻被下調(p0.05),ADC在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中并無顯著改變;空白組雙側FA、MD和ADC之間無差異;脂質體b FGF和b FGF給藥組對這3個參數(shù)值均無影響。6-OHDA能夠顯著上調橫向質子弛豫率(p0.05),并降低橫向質子弛豫時間(p0.05),中劑量的脂質體b FGF鼻腔給藥后下調了橫向質子弛豫率,升高了橫向質子弛豫時間(p0.05),這兩種作用與低劑量之間有顯著性差異。另外,6-OHDA能夠導致腦血流量的減少(p0.05),150μg/kg和600μg/kg兩個劑量的脂質體b FGF鼻腔給藥后顯著上升了受損側紋狀體內感興趣區(qū)的血流量(p0.05);組間相比,150μg/kg的脂質體b FGF組對血流量的增加作用效果更好(p0.05)。(8)6-OHDA能夠減少微管蛋白的表達,增加大鼠黑質內α-syn Ser129位點和tau Ser 396位點的磷酸化,上調CK-1,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);而脂質體b FGF鼻腔給藥后,能夠增加微管蛋白和DCX的表達,降低大鼠黑質內α-syn Ser129位點和tau Ser 396位點的磷酸化,下調CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信號通路(p0.05);6-OHDA和b FGF對大鼠黑質內DJ-1,Parkin,PINK和Synapsin均沒有顯著的調控作用。(9)脂質體b FGF和b FGF經鼻腔給藥后,在大鼠體內的血藥濃度-時間曲線符合二室開放模型,加權為1。150μg/kg,300μg/kg和600μg/kg的脂質體b FGF與300μg/kg的b FGF鼻腔給藥后的消除半衰期分別為174.5±29.2min,207.4±73.6min,260.6±41.6min,60.7±16.9min;藥時曲線下面積分別為672.6±86.6μg/L*min,1324.9±175.3μg/L*min,2191.8±256.3μg/L*min,700.1±122.3μg/L*min。(10)45mg/kg的脂質體b FGF和b FGF靜脈注射后,小鼠無一例死亡,且生活狀態(tài)良好,雄性小鼠兩個實驗組體重呈現(xiàn)持續(xù)增長狀態(tài),與空白對照組相比,均無顯著性差異(P0.05);而雌性小鼠b FGF給藥組的體重在給藥后的第一周幾乎沒有增加,在第二周過后又恢復正常。(11)各臟器HE染色結果與空白組相比,均未見有顯著意義的病理學改變。(12)6-OHDA處理后,細胞的存活率降低,50~100μM的6-OHDA對細胞幾乎沒有影響,150,200,250和300μM的6-OHDA誘導后,細胞的存活率分別為16%,40%,52%和61%,100 ng/ml,500 ng/ml和1000 ng/ml的b FGF預處理組細胞存活率明顯上調。(13)超微水平觀察細胞形態(tài)學,200μM的6-OHDA能夠損傷SH-SY5Y細胞,使其嚴重變形,破裂,細胞質外泄,軸突變短,而b FGF預處理過的細胞則能夠對抗6-OHDA所產生的毒性,改善細胞的形態(tài),維持細胞結構的完整性。(14)6-OHDA能夠減少微管蛋白和突觸蛋白的表達,上調CK-1和PLK-2,增加SY-SY5Y細胞內α-syn Ser129位點和tau Ser 396位點的磷酸化,抑制PI3K(Tyr458),AKT(Ser473)和GSK-3α/β(Ser21/9)的磷酸化(p0.05);b FGF能夠增加tubulin,α-syn和DCX的表達,降低SY-SY5Y細胞內α-syn Ser129位點和tau Ser 396位點的磷酸化,下調CK-1,激活PI3K/AKT/GSK-3信號通路(p0.05)。結論:(1)體內外實驗均證明,b FGF在6-OHDA誘導的PD模型中具有神經保護作用。(2)b FGF通過下調α-syn Ser129位點磷酸化和tau蛋白Ser 396位點的磷酸化來減少6-OHDA引起的神經毒性。(3)b FGF通過下調CK-1的表達從而減少α-syn Ser129位點磷酸化;b FGF通過激活PI3K/AKT/GSK-3信號通路來調控tau蛋白Ser 396位點的磷酸化。(4)脂質體能夠幫助b FGF延長半衰期,使其消除速率減慢;同時增加b FGF在大腦皮質和紋狀體內的分布。(5)脂質體b FGF和b FGF對小鼠的最大耐受劑量大于45mg/kg,且對大鼠鼻黏膜,嗅球,黑質紋狀體,肝臟和肺均無病理學的損傷作用。
[Abstract]:Objective: To study the effect of basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor, B FGF) in 6- (6-hydroxydopamine, 6-OHDA) of 6-hydroxydopamine induced Parkinson (Parkinson 's disease, PD) model in rats, and explore its mechanism. At the same time to evaluate the pharmacokinetics and safety of B FGF, provide the theoretical basis for the clinical treatment of Parkinson, the route of Administration for the B FGF to provide safe and effective. Methods: (1) by stereotaxic system 6-OHDA was injected into the striatum of SD rat model was made by liposome and intranasal administration of B FGF (delivered into the brain. 2) behavior (rotation experiment, gait analysis experiment and field test was used to detect the effect of B FGF) and B FGF liposome on PD model induced by 6-OHDA. (3) the electrochemical liquid chromatography (HPLC-ECD) detection in the rat striatum neurotransmitters DA and its metabolic products 鐗〥OPAC鍜孒VA嫻撳害.(4)鍏嶇柅緇勫寲娉曞拰鍏嶇柅鍗拌抗娉曟嫻嬬汗鐘朵綋鍜岄粦璐ㄥ唴TH鐨勮〃杈，

本文編號：1456393