本文關(guān)鍵詞：ephrinB2-EphB4正向信號(hào)介導(dǎo)的TNF-α調(diào)控成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的骨組織是一個(gè)活躍的、動(dòng)態(tài)的組織,在營(yíng)養(yǎng)、激素、機(jī)械等刺激下不斷更新。成骨細(xì)胞是一種間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞,它在骨組織形成和維持骨穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。一方面,成骨細(xì)胞參與骨組織的構(gòu)成,維持骨結(jié)構(gòu)的完整,能夠合成和分泌多種成骨相關(guān)蛋白,形成細(xì)胞外基質(zhì),調(diào)節(jié)骨的礦化;另一方面,成骨細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子或者通過(guò)細(xì)胞間直接接觸調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化及活性。成骨細(xì)胞功能的異常參與了人類(lèi)多種以骨改建異常為主要表現(xiàn)的疾病的病理過(guò)程。因此,研究病理狀態(tài)對(duì)成骨細(xì)胞的影響對(duì)于疾病的預(yù)防和治療具有十分重要的意義。牙周炎是臨床上常見(jiàn)的一種以牙菌斑為始動(dòng)因子的慢性、細(xì)菌感染性、炎癥性疾病,它的特征病理改變之一是牙槽骨吸收。牙周致病菌入侵后將引發(fā)機(jī)體中一系列炎癥介質(zhì)的表達(dá),激活宿主的免疫炎性反應(yīng)過(guò)程,產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子。促炎細(xì)胞因子TNF-α已被證實(shí)是牙周炎病理過(guò)程中的關(guān)鍵因子,它具有多種生物學(xué)活性。TNF-α對(duì)破骨分化的促進(jìn)作用較為明確,但是,TNF-α對(duì)成骨分化的作用尚存在很大爭(zhēng)議�，F(xiàn)有的研究結(jié)果顯示TNF-α能夠抑制體外培養(yǎng)的間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞的成骨分化,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TNF-α對(duì)骨形成有抑制作用。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)、成骨細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞(DPSCs)的成骨分化。TNF-α與其受體結(jié)合后能夠激活多條通路,這些信號(hào)通路相互作用、相互制衡,共同調(diào)節(jié)成骨分化。在牙周炎的發(fā)展過(guò)程中,炎癥過(guò)程的持續(xù)時(shí)間和作用強(qiáng)度差別較大,而TNF-α等炎性介質(zhì)的水平不斷起伏變化,牙槽骨破壞的靜止期和活動(dòng)期交替進(jìn)行。骨折對(duì)骨改建也有很大影響,但是值得注意的是,在骨折愈合過(guò)程中,TNF-α作為一種非常重要的促炎細(xì)胞因子參與了骨再生的過(guò)程,對(duì)骨折愈合起重要的促進(jìn)作用。因此明確不同強(qiáng)度的炎癥環(huán)境對(duì)成骨分化的影響及其生物學(xué)基礎(chǔ),對(duì)于進(jìn)一步了解炎癥過(guò)程的分子生物學(xué)機(jī)制并指導(dǎo)開(kāi)發(fā)新的牙周病治療手段尤為重要。NF-κB信號(hào)通路已被證實(shí)是TNF-α下游的關(guān)鍵信號(hào)之一。TNF-αα與其受體結(jié)合后能夠通過(guò)一系列反應(yīng)激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào),從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用NF-κB的拮抗劑阻斷TNF-α對(duì)NF-κB信號(hào)的活化作用后,TNF-αα對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化的抑制作用被逆轉(zhuǎn);在ST2的成骨分化過(guò)程中,TNF-α活化的NF-κB信號(hào)通路通過(guò)抑制Runx2基因的表達(dá)對(duì)ST2細(xì)胞的成骨分化發(fā)揮抑制作用。因此,細(xì)胞內(nèi)活化的NF-κB信號(hào)與TNF-α介導(dǎo)的成骨分化抑制作用密切相關(guān)。EphrinB2-EphB4信號(hào)通路是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的骨改建過(guò)程中的一條重要的新通路。EphrinB2與EphB4結(jié)合后逆向信號(hào)通過(guò)ephrinB2配體傳入破骨細(xì)胞前體細(xì)胞,抑制其破骨分化;正向信號(hào)通過(guò)EphB4受體傳入成骨細(xì)胞,促進(jìn)成骨分化。因此,ephrinB2-EphB4信號(hào)在促進(jìn)骨形成的同時(shí)抑制了過(guò)度的骨吸收,在維持骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。炎癥過(guò)程是一種多因素參與的過(guò)程,炎癥微環(huán)境可以導(dǎo)致骨改建相關(guān)信號(hào)的變化。因此,炎癥刺激有可能通過(guò)ephrinB2-EphB4正向信號(hào)影響成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度TNF-α作為不同強(qiáng)度炎癥刺激,探討不同濃度TNF-α刺激對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響,并探討ephrinB2-EphB4正向信號(hào)在這個(gè)過(guò)程中的作用;同時(shí),還觀察了阻斷NF-κB信號(hào)通路對(duì)成骨細(xì)胞分化及EphB4表達(dá)的影響,初步探討TNF-α調(diào)控ephrinB2-EphB4正向信號(hào)的分子生物學(xué)機(jī)制,以期更加深入了解炎癥刺激對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制,為開(kāi)發(fā)牙周病治療方法提供新思路。材料和方法1.TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化影響的研究復(fù)蘇液氮中凍存的MC3T3-E1細(xì)胞,傳代2次后,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。RT-PCR檢測(cè)不同濃度TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞Runx2和BSP mRNA表達(dá)的影響;Western blot檢測(cè)不同濃度TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞Runx2和BSP蛋白表達(dá)的影響;應(yīng)用堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒檢測(cè)不同濃度TNF-α處理后MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性;茜素紅染色法檢測(cè)不同濃度TNF-α處理對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響并且應(yīng)用十六烷基氯化吡啶將鈣離子析出后酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液吸光度值從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣含量進(jìn)行半定量分析。2.TNF-α調(diào)控MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的信號(hào)通路研究RT-PCR檢測(cè)不同濃度的TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)EphB4 mRNA表達(dá)的影響;Western blot檢測(cè)不同濃度TNF-α處理后MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)EphB4蛋白表達(dá)水平。構(gòu)建攜帶EphB4 siRNA的慢病毒載體,用脂質(zhì)體法包裝攜帶EphB4 siRNA的慢病毒。慢病毒感染MC3T3-E1細(xì)胞建立EphB4基因干擾的MC3T3-E1細(xì)胞模型后分別應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EphB4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)EphB4被干擾后應(yīng)用TNF-α處理,Western blot檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因Runx2和BSP蛋白表達(dá)水平;堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響;茜素紅染色法檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響并且應(yīng)用十六烷基氯化吡啶將鈣離子析出后酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液吸光度值從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣含量進(jìn)行半定量分析。用ephrinB2-fc 激活 MC3T3-E1 細(xì)胞內(nèi) ephrinB2-EphB4 正向信號(hào)后,Western blot檢測(cè)TNF-α對(duì)Runx2和BSP蛋白表達(dá)水平的影響;堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響;茜素紅染色法檢測(cè)TNF-α處理對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響并且應(yīng)用十六烷基氯化吡啶將鈣離子析出后酶標(biāo)儀檢測(cè)溶液吸光度值從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣含量進(jìn)行半定量分析。3.TNF-α調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)ephrinB2-EphB4正向信號(hào)的分子生物學(xué)機(jī)制初步研究Western blot 檢測(cè) TNF-α 對(duì) MC3T3-E1 細(xì)胞 NF-κB 信號(hào)的影響;用 NF-κB抑制劑PDTC處理MC3T3-E1細(xì)胞,Western blot檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞p-NF-κB p65、Runx2、BSP及EphB4蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果1.TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化影響與對(duì)照組(0ng/mlTNF-α)相比,TNF-α處理24、48小時(shí)后,MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)Runx2和BSP mRNA和蛋白表達(dá)在低濃度(0.1和1 ng/ml)時(shí)升高,在高濃度(10ng/ml)時(shí)明顯降低;TNF-α刺激7、14天后,MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性在低濃度(0.1和1ng/ml)時(shí)明顯升高,在高濃度(10ng/ml)明顯降低;TNF-αα處理28天后,細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)量在低濃度(0.1和1ng/ml)時(shí)增多,在高濃度(10ng/ml)時(shí)明顯減少,同時(shí),鈣含量檢測(cè)結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞鈣含量在低濃度(0.1和1ng/ml)明顯升高,在高濃度(10ng/ml)時(shí)明顯減低。2.ephrinB2-EphB4正向信號(hào)在TNF-α調(diào)控成骨分化中的作用(1)低濃度(0.1 和 1ng/ml)TNF-α 處理 24、48 小時(shí)后,MC3T3-E1 細(xì)胞 EphB4的mRNA和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組(0ng/mlTNF-α)相比明顯升高,高濃度(10 ng/ml)TNF-α處理24、48小時(shí)后,MC3T3-E1細(xì)胞EphB4的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組(0 ng/ml TNF-α)相比明顯降低。(2)慢病毒感染MC3T3-E1細(xì)胞后,ephrinB2-EphB4正向信號(hào)被干擾,結(jié)果顯示與陰性對(duì)照病毒感染組相比,干擾組MC3T3-E1細(xì)胞的EphB4 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低。(3)與對(duì)照組相比,低濃度TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)Runx2和BSP蛋白表達(dá)、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)的形成有明顯促進(jìn)作用。干擾ephrinB2-EphB4正向信號(hào)逆轉(zhuǎn)了低濃度TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞上述成骨分化相關(guān)指標(biāo)的促進(jìn)作用。(4)與對(duì)照組相比,高濃度TNF-α對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)Runx2和BSP蛋白表達(dá)、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)的形成有明顯抑制作用。同時(shí)應(yīng)用ephrinB2-fc和TNF-αα處理MC3T3-E1細(xì)胞后,Runx2和BSP蛋白表達(dá)、ALP活性和形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量與單獨(dú)應(yīng)用TNF-α處理組相比明顯升高。3.TNF-α調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)ephrinB2-EphB4正向信號(hào)的分子生物學(xué)機(jī)制(1)應(yīng)用10 ng/ml TNF-α處理MC3T3-E1細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65水平較未處理組明顯升高;MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)PDTC預(yù)處理后加入TNF-α處理,細(xì)胞內(nèi)p-NF-κB p65水平較單純TNF-α處理組明顯降低。(2)與對(duì)照組(0ng/mlTNF-α)相比,10ng/mlTNF-α 處理 24、48 小時(shí)后 MC3T3-E1細(xì)胞Runx2和BSP蛋白表達(dá)明顯降低;MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)PDTC預(yù)處理后加入TNF-α處理,Runx2和BSP蛋白表達(dá)較單純TNF-α處理組明顯升高。(3)與對(duì)照組(0ng/mlTNF-α)相比,TNF-α處理24、48小時(shí)后MC3T3-E1細(xì)胞EphB4蛋白的表達(dá)降低。PDTC預(yù)處理后加入TNF-α處理,MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)EphB4表達(dá)較單獨(dú)應(yīng)用TNF-α處理組明顯升高。結(jié)論1.不同濃度TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響不同,低濃度的TNF-α促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,而高濃度的TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化。2.ephrinB2-EphB4正向信號(hào)被干擾后,逆轉(zhuǎn)了低濃度的TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用;應(yīng)用ephrinB2-fc后,高濃度的TNF-α處理的成骨細(xì)胞的成骨分化相關(guān)指標(biāo)與單獨(dú)應(yīng)用TNF-α處理組相比明顯升高。結(jié)果提示TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響是通過(guò)ephrinB2-EphB4正向信號(hào)介導(dǎo)的。3.NF-κB信號(hào)的抑制劑阻斷了高濃度的TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化和對(duì)EphB4表達(dá)的抑制作用,提示高濃度的TNF-α可能通過(guò)活化NF-κB信號(hào)來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)ephrinB2-EphB4 正向信號(hào)。
[Abstract]:TNF - 偽 has been proved to be a key factor in the pathogenesis of bone remodeling . The effects of different concentrations of TNF - 偽 on the expression of EphB4 mRNA in MC3T3 - E1 cells were investigated by Western blot . The levels of mRNA and protein in MC3T3 - E1 cells were significantly lower at low concentrations ( 0.1 and 1 ng / ml ) than those in control group ( 0 . 1 and 1 ng / ml ) . The results suggested that TNF - 偽 inhibited the differentiation of osteoblast and inhibited the differentiation of osteoblast . Conclusion : TNF - 偽 inhibited the differentiation of osteoblast and inhibited the differentiation of osteoblast .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：1440680