發(fā)布時(shí)間：2018-01-17 20:12

  本文關(guān)鍵詞：PLAC1與妊娠期糖尿病相關(guān)研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：1型、2型糖尿病及妊娠期糖尿病(Gestationaldiabetesmellitus,GDM)在全球范圍內(nèi)流行,過去20年間,患病率逐漸增加,尤其是在中國。我國已經(jīng)成為世界上發(fā)病率最高的國家之一。GDM是妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)的葡萄糖不耐受的狀態(tài),給母親、胎兒及新生兒帶來近遠(yuǎn)期并發(fā)癥,包括巨大兒、羊水過多、并發(fā)子癇前期、新生兒低血糖、新生兒高胰島素血癥等,隨之而來的肩難產(chǎn)、剖宮產(chǎn)、產(chǎn)傷、產(chǎn)后出血等危險(xiǎn)性顯著增加。孕期發(fā)生GDM,產(chǎn)后及子代未來發(fā)生2型糖尿病(Type 2diabetesmellitus,T2DM)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,并且發(fā)病呈年輕化趨勢。若為女性子代,將來罹患GDM的風(fēng)險(xiǎn)又大大升高。如此循環(huán)往復(fù),給我國人口素質(zhì)帶來嚴(yán)重的惡性影響。因此,如何從源頭上遏制GDM發(fā)生,是我們首要的研究目的。目前GDM病因未明,近年來的研究顯示,妊娠期的激素水平、自身免疫、遺傳、脂肪細(xì)胞因子水平、炎癥因子水平的變化,都或多或少加重了 GDM患者的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),在GDM的發(fā)病或病情進(jìn)展中發(fā)揮了作用,但上述所有致病因素尚不能完全解釋GDM的發(fā)病機(jī)制以及對(duì)胎兒近遠(yuǎn)期不良影響的作用環(huán)節(jié)因此也無法從源頭上加以預(yù)測和預(yù)防。胎盤是女性在妊娠期間產(chǎn)生的一個(gè)臨時(shí)性的、但極其重要的器官,它是母體與胎兒之間唯一的溝通渠道。母體具備健康的生理環(huán)境,才能促使胎盤正常地生長、發(fā)育、成熟,從而保證其正常地行使代謝功能,完成營養(yǎng)物質(zhì)以及氣體的輸送,保護(hù)胎兒逃逸母體的免疫系統(tǒng),確保胎兒的生長發(fā)育。然而,胎盤又是一個(gè)分泌器官,其合成的各類蛋白和豐富的激素反饋?zhàn)饔糜谀阁w,引起母體局部或系統(tǒng)性的改變,以維持妊娠過程順利進(jìn)行。GDM患者的胎盤形態(tài)上較正常孕婦的胎盤體積更大,且質(zhì)地脆、易碎。顯微鏡下可見50-60%的絨毛發(fā)育不成熟,絨毛直徑擴(kuò)大、水腫,合體細(xì)胞結(jié)節(jié)增多,干絨毛小動(dòng)脈管壁增厚,管腔狹窄,纖維蛋白樣壞死增多等表現(xiàn)。同時(shí)合體滋養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著的變化:游離面的絨毛短小、稀疏,線粒體腫脹,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,基底膜彎曲增厚。即使GDM孕婦孕期血糖控制良好,胎盤的這種形態(tài)和組織學(xué)上的改變并不能夠被改善。因此,研究胎盤病理生理以及其表達(dá)的基因、合成的蛋白質(zhì)是從源頭控制GDM的切入點(diǎn)。人類PLAC1(Placenta-specific1)蛋白僅在在胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞上表達(dá)。含有212個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子量約為28-30KDa,結(jié)構(gòu)上有一段高度保守的信號(hào)序列,4個(gè)糖基化位點(diǎn)和13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),推測在調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝和維持正常妊娠中起至關(guān)鍵作用。我們假設(shè)PLAC1表達(dá)改變引起能量代謝異常,從而導(dǎo)致了 GDM的發(fā)生和/或發(fā)展。擬從整體水平上檢測GDM孕婦和正常孕婦的胎盤內(nèi)PLAC1蛋白的表達(dá)量變化及其在胎盤內(nèi)的定位,并結(jié)合臨床資料分析PLAC1蛋白變化與GDM相關(guān)性。同時(shí),從細(xì)胞水平探討PLAC1蛋白變化對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響;并建立高糖細(xì)胞模型,探討PLAC1與瘦素(Leptin)之間的調(diào)控關(guān)系,以及兩者與GDM的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。從而能更深入的研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制,為篩選高特異性和靈敏性的生物指標(biāo)提供依據(jù),以期能早期預(yù)測妊娠期糖尿病的發(fā)生和發(fā)展,改善母兒結(jié)局。第一部分妊娠期糖尿病孕婦PLAC1的表達(dá)及潛在臨床意義研究目的:觀察PLAC1在妊娠期糖尿病(GDM)胎盤組織中的表達(dá)和定位,分析其與GDM孕婦臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性。方法:選取在我院定期產(chǎn)檢并行剖宮產(chǎn)手術(shù)分娩的孕婦共75例,其中37例孕婦被診斷為GDM,38例為正常對(duì)照。收集入組病例的相關(guān)臨床資料并整理信息,收集入組孕婦的空腹血液及胎盤組織。采用糖氧化酶比色法測定空腹血糖(FPG),采用化學(xué)發(fā)光法和酶測定法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定空腹胰島素(Fins)。采用Western blot及免疫組織化學(xué)技術(shù)測定胎盤組織內(nèi)的PLAC1表達(dá)量及分布。并分析PLAC1的表達(dá)量與臨床資料及血液指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果:1.GDM 組孕婦的 FPG 為 3.98±0.98 mmol/L、HbA1c 為 5.44±0.60%、OGTT Oh為 5.29±1.11 mmol/L、OGTT 1h 為 10.84±2.58 mmol/L、OGTT 2h 為 8.89±1.72 mmol/L、新生兒的出生體重為3606.76±445.06g均顯著高于對(duì)照組,分別為3.58±0.65mmol/L、5.08±0.41%、4.48±0.26 mmol/L、8.19±1.17mmol/L、6.62±0.91 mmol/L、3404.47±337.52g,(p0.05)。2.GDM孕婦胎盤內(nèi)的PLAC1的表達(dá)量(1.08±0.64)低于正常對(duì)照的胎盤PLAC1的表達(dá)量(1.75±1.28),且差異具有顯著性(p0.01)。3.正常妊娠情況下PLAC1蛋白與分娩時(shí)BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相關(guān),在GDM情況下卻與這些指標(biāo)無相關(guān)關(guān)系。4.胎盤組織免疫組織化學(xué)技術(shù)檢查結(jié)果:GDM孕婦胎盤,不成熟絨毛均較多見,細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增多,小血管管腔明顯狹窄,合體細(xì)胞結(jié)節(jié)明顯增多,纖維蛋白樣壞死的絨毛增多。PLAC1蛋白在胎盤組織內(nèi)呈棕色強(qiáng)陽性表達(dá),并且表達(dá)主要分布在絨毛間質(zhì)及合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。對(duì)照組胎盤胎兒面及母體面的PLAC1蛋白表達(dá)水平明顯高于GDM組。結(jié)論:PLAC1蛋白在胎盤內(nèi)主要表達(dá)在合體滋養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)和絨毛間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),同時(shí)在GDM胎盤內(nèi)表達(dá)顯著下降,正常妊娠情況下其與分娩時(shí)BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相關(guān),在GDM情況下卻與這些指標(biāo)無相關(guān)關(guān)系,說明PL AC 1與調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝活動(dòng)關(guān)系密切,同時(shí)提示GDM的發(fā)生、發(fā)展與胎盤內(nèi)PLAC1蛋白含量減少相關(guān)。第二部分PLAC1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究目的:明確PLAC1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的調(diào)控作用。方法:利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),在滋養(yǎng)細(xì)胞系SWAN及JAR中轉(zhuǎn)染PLAC1小干擾序列下調(diào)PLAC1的表達(dá),或在上述兩種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染PLAC1質(zhì)粒上調(diào)PLAC1的表達(dá),分別通過CCK-8法檢查滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力,Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel基質(zhì)膠來檢測滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Western blot法檢測PLAC1蛋白水平。結(jié)果:1.SWAN細(xì)胞干擾效率為62%,JAR細(xì)胞干擾效率為58%。SWAN細(xì)胞上調(diào)效率為159%,JAR細(xì)胞上調(diào)效率為278%。均具有顯著差異2.在滋養(yǎng)細(xì)胞系里,下調(diào)PLAC1的表達(dá)可以明顯抑制SWAN及JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。3.在滋養(yǎng)細(xì)胞系里,上調(diào)PLAC1的表達(dá)可以顯著促進(jìn)SWAN及JAR細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。結(jié)論:PLAC1低表達(dá)可以明顯抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移的能力,提示PLAC1表達(dá)降低可以引起滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常,影響胎盤的正常生長發(fā)育,進(jìn)一步影響母體GDM和其他妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。第三部分滋養(yǎng)細(xì)胞高糖培養(yǎng)下PLAC1的變化及其與Leptin之間的相關(guān)研究研究目的:通過高糖培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞來模擬人體內(nèi)血糖變化的環(huán)境,從而研究不同的血糖水平下PLAC1的變化情況。以及了解PLAC1與引起GDM相關(guān)因子Leptin之間的關(guān)系。方法:用兩種不同糖濃度的培養(yǎng)基以及甘露醇高滲培養(yǎng)基分別培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞系SWAN及JAR細(xì)胞。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),在滋養(yǎng)細(xì)胞系SWAN及JAR中轉(zhuǎn)染PLAC1小干擾序列下調(diào)PLAC1的表達(dá),來觀察上述兩種細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)Leptin的水平變化。同時(shí),在上述兩種細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染PLAC1質(zhì)粒上調(diào)PLAC1的表達(dá),來觀察上述兩種細(xì)胞內(nèi)Leptin的表達(dá)。Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)PLAC1及Leptin蛋白水平。Elisa法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)Leptin蛋白水平。結(jié)果:1.高糖培養(yǎng)下的滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)PLAC1的表達(dá)顯著下降,Leptin的表達(dá)及分泌到培養(yǎng)上清內(nèi)的Leptin顯著增加2.在滋養(yǎng)細(xì)胞系里,下調(diào)PLAC1的表達(dá)后,Leptin的合成及分泌顯著增加。3.在滋養(yǎng)細(xì)胞系里,上調(diào)PLAC1的表達(dá)后,Leptin的表達(dá)顯著降低。結(jié)論:PLAC1的表達(dá)可受到高糖環(huán)境刺激而下降,同時(shí)PLAC1水平降低可導(dǎo)致Leptin的合成和分泌增加,PLAC1水平上升,可導(dǎo)致Leptin的合成和分泌減少。PLAC1對(duì)Leptin的調(diào)控作用可能導(dǎo)致了 GDM的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:In the past 20 years , there has been a significant increase in the risk of diabetes mellitus ( T2DM ) , especially in China . In recent years , it has become one of the most prevalent countries in the world . Objective : To study the relationship between the changes of placental morphology and the expression of insulin resistance in pregnant women . In the control group , there was a positive correlation between BMI , Fins , TG and insulin - IR in the placenta of the pregnant women . The results showed that the expression level of bcl - 1 protein in the placenta was significantly higher than that in the control group . The expression of leptin in human body and JAR cells was investigated by Western blot . The results showed that : 1 . The expression of intercellular adhesion molecule 1 and the expression of leptin were detected by Western blot . Results : 1 . The expression of leptin in cultured cells was significantly decreased by Western blot . Results : 1 . The expression and secretion of leptin in cultured cells were significantly decreased by Western blot .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.256

【參考文獻(xiàn)】

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1 王亞男;李真;校審;;瘦素受體與妊娠相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2013年04期

2 康雪冰;李元梅;劉月萍;;瘦素與老年患者胰島素抵抗和胰島功能的相關(guān)性[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2011年13期

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本文編號(hào)：1437787