本文關鍵詞：PLAC1與妊娠期糖尿病相關研究　出處：《浙江大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：1型、2型糖尿病及妊娠期糖尿病(Gestationaldiabetesmellitus,GDM)在全球范圍內流行,過去20年間,患病率逐漸增加,尤其是在中國。我國已經成為世界上發(fā)病率最高的國家之一。GDM是妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)的葡萄糖不耐受的狀態(tài),給母親、胎兒及新生兒帶來近遠期并發(fā)癥,包括巨大兒、羊水過多、并發(fā)子癇前期、新生兒低血糖、新生兒高胰島素血癥等,隨之而來的肩難產、剖宮產、產傷、產后出血等危險性顯著增加。孕期發(fā)生GDM,產后及子代未來發(fā)生2型糖尿病(Type 2diabetesmellitus,T2DM)的風險顯著增加,并且發(fā)病呈年輕化趨勢。若為女性子代,將來罹患GDM的風險又大大升高。如此循環(huán)往復,給我國人口素質帶來嚴重的惡性影響。因此,如何從源頭上遏制GDM發(fā)生,是我們首要的研究目的。目前GDM病因未明,近年來的研究顯示,妊娠期的激素水平、自身免疫、遺傳、脂肪細胞因子水平、炎癥因子水平的變化,都或多或少加重了 GDM患者的胰島素抵抗狀態(tài),在GDM的發(fā)病或病情進展中發(fā)揮了作用,但上述所有致病因素尚不能完全解釋GDM的發(fā)病機制以及對胎兒近遠期不良影響的作用環(huán)節(jié)因此也無法從源頭上加以預測和預防。胎盤是女性在妊娠期間產生的一個臨時性的、但極其重要的器官,它是母體與胎兒之間唯一的溝通渠道。母體具備健康的生理環(huán)境,才能促使胎盤正常地生長、發(fā)育、成熟,從而保證其正常地行使代謝功能,完成營養(yǎng)物質以及氣體的輸送,保護胎兒逃逸母體的免疫系統(tǒng),確保胎兒的生長發(fā)育。然而,胎盤又是一個分泌器官,其合成的各類蛋白和豐富的激素反饋作用于母體,引起母體局部或系統(tǒng)性的改變,以維持妊娠過程順利進行。GDM患者的胎盤形態(tài)上較正常孕婦的胎盤體積更大,且質地脆、易碎。顯微鏡下可見50-60%的絨毛發(fā)育不成熟,絨毛直徑擴大、水腫,合體細胞結節(jié)增多,干絨毛小動脈管壁增厚,管腔狹窄,纖維蛋白樣壞死增多等表現(xiàn)。同時合體滋養(yǎng)細胞的超微結構會發(fā)生顯著的變化:游離面的絨毛短小、稀疏,線粒體腫脹,粗面內質網擴張,基底膜彎曲增厚。即使GDM孕婦孕期血糖控制良好,胎盤的這種形態(tài)和組織學上的改變并不能夠被改善。因此,研究胎盤病理生理以及其表達的基因、合成的蛋白質是從源頭控制GDM的切入點。人類PLAC1(Placenta-specific1)蛋白僅在在胎盤的滋養(yǎng)細胞上表達。含有212個氨基酸的蛋白質,分子量約為28-30KDa,結構上有一段高度保守的信號序列,4個糖基化位點和13個潛在的磷酸化位點,推測在調節(jié)機體糖代謝和維持正常妊娠中起至關鍵作用。我們假設PLAC1表達改變引起能量代謝異常,從而導致了 GDM的發(fā)生和/或發(fā)展。擬從整體水平上檢測GDM孕婦和正常孕婦的胎盤內PLAC1蛋白的表達量變化及其在胎盤內的定位,并結合臨床資料分析PLAC1蛋白變化與GDM相關性。同時,從細胞水平探討PLAC1蛋白變化對滋養(yǎng)細胞功能的影響;并建立高糖細胞模型,探討PLAC1與瘦素(Leptin)之間的調控關系,以及兩者與GDM的胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的關系。從而能更深入的研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機制,為篩選高特異性和靈敏性的生物指標提供依據(jù),以期能早期預測妊娠期糖尿病的發(fā)生和發(fā)展,改善母兒結局。第一部分妊娠期糖尿病孕婦PLAC1的表達及潛在臨床意義研究目的:觀察PLAC1在妊娠期糖尿病(GDM)胎盤組織中的表達和定位,分析其與GDM孕婦臨床指標之間的相關性。方法:選取在我院定期產檢并行剖宮產手術分娩的孕婦共75例,其中37例孕婦被診斷為GDM,38例為正常對照。收集入組病例的相關臨床資料并整理信息,收集入組孕婦的空腹血液及胎盤組織。采用糖氧化酶比色法測定空腹血糖(FPG),采用化學發(fā)光法和酶測定法測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定空腹胰島素(Fins)。采用Western blot及免疫組織化學技術測定胎盤組織內的PLAC1表達量及分布。并分析PLAC1的表達量與臨床資料及血液指標的相關性。結果:1.GDM 組孕婦的 FPG 為 3.98±0.98 mmol/L、HbA1c 為 5.44±0.60%、OGTT Oh為 5.29±1.11 mmol/L、OGTT 1h 為 10.84±2.58 mmol/L、OGTT 2h 為 8.89±1.72 mmol/L、新生兒的出生體重為3606.76±445.06g均顯著高于對照組,分別為3.58±0.65mmol/L、5.08±0.41%、4.48±0.26 mmol/L、8.19±1.17mmol/L、6.62±0.91 mmol/L、3404.47±337.52g,(p0.05)。2.GDM孕婦胎盤內的PLAC1的表達量(1.08±0.64)低于正常對照的胎盤PLAC1的表達量(1.75±1.28),且差異具有顯著性(p0.01)。3.正常妊娠情況下PLAC1蛋白與分娩時BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相關,在GDM情況下卻與這些指標無相關關系。4.胎盤組織免疫組織化學技術檢查結果:GDM孕婦胎盤,不成熟絨毛均較多見,細胞滋養(yǎng)細胞增多,小血管管腔明顯狹窄,合體細胞結節(jié)明顯增多,纖維蛋白樣壞死的絨毛增多。PLAC1蛋白在胎盤組織內呈棕色強陽性表達,并且表達主要分布在絨毛間質及合體滋養(yǎng)細胞的胞質內。對照組胎盤胎兒面及母體面的PLAC1蛋白表達水平明顯高于GDM組。結論:PLAC1蛋白在胎盤內主要表達在合體滋養(yǎng)細胞的胞質內和絨毛間質細胞胞質內,同時在GDM胎盤內表達顯著下降,正常妊娠情況下其與分娩時BMI、Fins、TG及HOMA-IR呈正相關,在GDM情況下卻與這些指標無相關關系,說明PL AC 1與調節(jié)體內代謝活動關系密切,同時提示GDM的發(fā)生、發(fā)展與胎盤內PLAC1蛋白含量減少相關。第二部分PLAC1對滋養(yǎng)細胞生物學行為的影響研究目的:明確PLAC1對滋養(yǎng)細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的調控作用。方法:利用細胞轉染技術,在滋養(yǎng)細胞系SWAN及JAR中轉染PLAC1小干擾序列下調PLAC1的表達,或在上述兩種細胞系中轉染PLAC1質粒上調PLAC1的表達,分別通過CCK-8法檢查滋養(yǎng)細胞的增殖能力,Transwell聯(lián)合或不聯(lián)合matrigel基質膠來檢測滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力。Western blot法檢測PLAC1蛋白水平。結果:1.SWAN細胞干擾效率為62%,JAR細胞干擾效率為58%。SWAN細胞上調效率為159%,JAR細胞上調效率為278%。均具有顯著差異2.在滋養(yǎng)細胞系里,下調PLAC1的表達可以明顯抑制SWAN及JAR細胞的增殖、侵襲和遷移能力。3.在滋養(yǎng)細胞系里,上調PLAC1的表達可以顯著促進SWAN及JAR細胞的增殖、侵襲和遷移能力。結論:PLAC1低表達可以明顯抑制滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲、遷移的能力,提示PLAC1表達降低可以引起滋養(yǎng)細胞功能異常,影響胎盤的正常生長發(fā)育,進一步影響母體GDM和其他妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。第三部分滋養(yǎng)細胞高糖培養(yǎng)下PLAC1的變化及其與Leptin之間的相關研究研究目的:通過高糖培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞來模擬人體內血糖變化的環(huán)境,從而研究不同的血糖水平下PLAC1的變化情況。以及了解PLAC1與引起GDM相關因子Leptin之間的關系。方法:用兩種不同糖濃度的培養(yǎng)基以及甘露醇高滲培養(yǎng)基分別培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞系SWAN及JAR細胞。利用細胞轉染技術,在滋養(yǎng)細胞系SWAN及JAR中轉染PLAC1小干擾序列下調PLAC1的表達,來觀察上述兩種細胞內及細胞培養(yǎng)上清內Leptin的水平變化。同時,在上述兩種細胞系中轉染PLAC1質粒上調PLAC1的表達,來觀察上述兩種細胞內Leptin的表達。Western blot法檢測細胞內PLAC1及Leptin蛋白水平。Elisa法檢測細胞培養(yǎng)上清內Leptin蛋白水平。結果:1.高糖培養(yǎng)下的滋養(yǎng)細胞內PLAC1的表達顯著下降,Leptin的表達及分泌到培養(yǎng)上清內的Leptin顯著增加2.在滋養(yǎng)細胞系里,下調PLAC1的表達后,Leptin的合成及分泌顯著增加。3.在滋養(yǎng)細胞系里,上調PLAC1的表達后,Leptin的表達顯著降低。結論:PLAC1的表達可受到高糖環(huán)境刺激而下降,同時PLAC1水平降低可導致Leptin的合成和分泌增加,PLAC1水平上升,可導致Leptin的合成和分泌減少。PLAC1對Leptin的調控作用可能導致了 GDM的發(fā)生發(fā)展。
[Abstract]:In the past 20 years , there has been a significant increase in the risk of diabetes mellitus ( T2DM ) , especially in China . In recent years , it has become one of the most prevalent countries in the world . Objective : To study the relationship between the changes of placental morphology and the expression of insulin resistance in pregnant women . In the control group , there was a positive correlation between BMI , Fins , TG and insulin - IR in the placenta of the pregnant women . The results showed that the expression level of bcl - 1 protein in the placenta was significantly higher than that in the control group . The expression of leptin in human body and JAR cells was investigated by Western blot . The results showed that : 1 . The expression of intercellular adhesion molecule 1 and the expression of leptin were detected by Western blot . Results : 1 . The expression of leptin in cultured cells was significantly decreased by Western blot . Results : 1 . The expression and secretion of leptin in cultured cells were significantly decreased by Western blot .

【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.256

【參考文獻】

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本文編號：1437787