本文關鍵詞：亞型選擇性丙酮酸脫氫酶激酶不可逆抑制劑及抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物開發(fā)　出處：《華東理工大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：本論文由兩部分組成:第一部分是亞型選擇性丙酮酸脫氫酶激酶不可逆抑制劑的研究。癌細胞的代謝異常是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織有別于正常組織的特征之一。其中,以腫瘤細胞對葡萄糖的代謝異常最為突出,主要表現(xiàn)為有氧糖酵解通路的增強和氧化磷酸化途徑的減弱,即腫瘤細胞即使在氧充足的條件下,也主要通過糖酵解的方式分解葡萄糖,而非通過三羧酸循環(huán)的氧化磷酸化途徑生產(chǎn)ATP,這種以有氧糖酵解為主的代謝方式被稱之為"Warburg"效應。這種看似低效的代謝方式能從能量和物質等多個方面滿足腫瘤細胞增殖的特殊需求。此外,"Warburg"效應還貢獻于腫瘤細胞的凋亡抵抗、惡性微環(huán)境的維持、轉移與耐藥等方面,是腫瘤細胞存活與增殖的基礎。酮酸脫氫酶激酶(PDK)能通過磷酸化丙酮酸脫氫酶(PDH)而改變細胞的葡萄糖代謝路徑,是細胞糖代謝調節(jié)網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點。PDK有四種亞型(PDK1-4),它們在人體內(nèi)具有特異性的組織分布,其中PDK1在大多數(shù)腫瘤細胞中都異常高表達,并且與癌癥患者的預后和生存、放化療響應、耐藥的產(chǎn)生等密切相關。因此,PDK1已成為靶向腫瘤糖代謝的抗癌策略中極具潛質的靶點。在本論文前,主要有三種PDK抑制劑類型見諸報道,以不同的結合位點加以區(qū)分。第一類抑制劑作用于丙酮酸結合位點,代表性化合物是二氯乙酸(DCA),DCA可以看做是PDC底物丙酮酸的小分子類似物,但其較弱的抗癌活性及往往需要過大給藥劑量(100 mg/kg)等因素影響了DCA的臨床應用。第二類抑制劑作用于二硫辛酸口袋,代表性化合物主要有Nov3r、AZD7545和CPI6I3。除了CPI613外,其它的該類抑制劑抗癌效果較弱,而CPI613作為輔酶因子二硫辛酸的模擬物,其副作用涵待考察。第三類抑制劑屬于ATP競爭型抑制劑,代表性化合物有Radicicol、M77976等,考慮到人體內(nèi)含有大量與ATP結合的酶,此類抑制劑的選擇性往往較差,由此產(chǎn)生的副作用很難避免。在先前的工作中,本課題組通過對課題組內(nèi)老藥庫的PDK1抑制活性篩選及簡單的化學改造發(fā)現(xiàn)了第一個PDK1不可逆抑制劑JX06。以JX06為探針,進一步發(fā)現(xiàn)了抑制劑作用于PDK1一個全新的結合口袋,并闡明了其共價修飾的酶活調控機制,提出了新的靶向PDK1策略。本論文進一步基于JX06的結構骨架,設計并合成了兩系列共42個含有二硫鍵的JX06衍生物(1a-m、2a-s、3a-j)。首先測試了這些衍生物對PDK1的半數(shù)抑制濃度(IC50),得到了初步的構效關系(SAR),發(fā)現(xiàn)了22個有顯著PDK1抑制活性的衍生物(1c-d、1f—m、2a-d、2f、2i、2j-k、2m-n、2p和3a,IC500.3μM)�？紤]到這些衍生物屬于共價抑制劑,我們引入了kinact/Ki(second-order rate constant of target inactivation)作為不可逆抑制劑抑制強度的定量指征對所得SAR進行了驗證,結果表明IC50與kinact/Ki表現(xiàn)出良好的相關性。進一步采用免疫印跡法在細胞水平測試了優(yōu)選的22個衍生物對PDK1的抑制活性,發(fā)現(xiàn)衍生物2k和3a在細胞水平展現(xiàn)出最優(yōu)的PDK1抑制活性,且具有良好的濃度依賴性,它們在所有測試濃度中對S232和S293兩個磷酸化位點都顯示出了良好的抑制效果。后續(xù)的一系列藥理實驗證實2k和3a是通過類似于JX06的共價機制對PDK1產(chǎn)生抑制,并藉此改變腫瘤細胞的葡萄糖代謝路徑。通過測試優(yōu)選衍生物2k、3a及先導化合物JX06對PDK四種亞型的kinact/Ki值,發(fā)現(xiàn)化合物3a表現(xiàn)出最強效的PDK1抑制活性(IC50= 26 nM;kinact/Ki=5.14×103M-1s-1),而且相比于PDK2-4抑制活性,3a對PDK1顯示出了超過40倍的亞型選擇性,該亞型選擇性明顯優(yōu)于JX06和2k。為了解釋3a對PDK1發(fā)揮選擇性抑制的分子機制,應用分子對接模擬出2k、3a和JX06與PDK1-4的相互作用模式,從共價反應距離和空間適配性等方面較好的闡釋了3a選擇性抑制PDK1的原因。接下來我們考察了JX06、2k和3a在體內(nèi)外的抗腫瘤藥效。在體外抑制細胞增殖實驗中,化合物3a對腫瘤細胞增殖的抑制效果最優(yōu),且對其它兩種人正常細胞沒有明顯的抑制作用。在動物體內(nèi)實驗中,3a表現(xiàn)出了與JX06類似的腫瘤抑制效果(TGI = 47.8%@ 80 mg/kg)。值得關注的是,3a對實驗動物體重沒有任何負面影響,明顯優(yōu)于JX06,我們認為這可能得益于其良好的PDK1亞型選擇性。本部分工作發(fā)現(xiàn)的化合物3a,作為第一代亞型選擇性PDK1不可逆抑制劑,有良好的潛力成為靶向腫瘤代謝通路研究中的工具分子或先導化合物。第二部分是抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物開發(fā)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)抗真菌老藥鹽酸萘替芬及其衍生物,作為金黃色葡萄球菌關鍵致病因子金黃色素合成通路催化酶CrtN的抑制劑,在感染前給藥(預防給藥)的模式中表現(xiàn)出了良好的體內(nèi)抗菌藥效。本論文以課題組前期發(fā)現(xiàn)的呋喃類CrtN抑制劑C13為先導結構,在保持C13良好的體內(nèi)外藥效的前提下,通過結構優(yōu)化來降低C13較強的hERG抑制毒性,并且探索在動物藥效評價中增加感染后給藥(治療給藥)的實驗組,試圖開發(fā)出具有良好成藥性和應用價值的抗耐藥金黃色葡萄球菌候選藥物。我們以C13為先導化合物,通過生物電子等排將C13結構中的苯并呋喃環(huán)替換成吲哚環(huán),并依據(jù)色素抑制活性(Newman菌株)對結構中的四個不同區(qū)域(A-D)分別進行了結構優(yōu)化,總結歸納出相應的構效關系。最終發(fā)現(xiàn)一個含有端位聯(lián)苯基團的衍生物44具有最強的Newman菌株色素抑制活性(IC50= 3.3 nM),化合物44在三株耐藥金黃色葡萄球菌株USA300、USA400及Mu50的色素抑制活性測試中也表現(xiàn)出了納摩爾級別的色素抑制活性。在高達0.2 mM的藥物濃度下,44對上述四株細菌的生長沒有明顯的不良影響,證實了化合物44并不抑制細菌的生長,而是僅僅消減細菌的致病力。通過高效液相色譜分析給藥前后細菌金黃色素代謝通路的代謝物變化情況,證實CrtN是化合物44的作用靶標,在細菌細胞裂解液中發(fā)現(xiàn)44對CrtN具有強效的酶抑制活性。在過氧化氫(模擬活性氧)及人血的免疫殺傷模型中,化合物44能夠顯著提高細菌對免疫殺傷的響應,表現(xiàn)出了良好的體外抑菌效果,從功能上驗證了化合物44是通過消減細菌致病力發(fā)揮抗菌藥效。在小鼠系統(tǒng)感染Newman菌株實驗中,化合物44在感染前給藥和感染后給藥兩種模式中都表現(xiàn)出了良好的抗菌藥效,可顯著地降低Newman菌在小鼠腎臟、心臟和肝臟中的定植(抑菌率普遍高于95%)。針對致死劑量Newman菌供毒的敗血癥模型中,化合物44也能有效延長小鼠的存活時間。此外,體外抗真菌活性測試結果顯示,化合物44完全喪失了抗真菌活性,表現(xiàn)出選擇性的抗細菌活性。最后我們測試了化合物44對hERG鉀通道的抑制活性,結果表明44幾乎沒有hERG抑制毒性(IC5040 μM),遠優(yōu)于先導化合物C13(IC50= 3.7 μM)。目前本課題組正在開展化合物44對耐藥金黃色葡萄球菌的體內(nèi)抗菌活性評價。已有的結果表明本論文針對C13的結構優(yōu)化是成功的,最優(yōu)化合物44不但保持了先導化合物C13強效的體內(nèi)外抗菌活性,而且極大地改善了對hERG抑制帶來的潛在心臟毒性。在新設計的小鼠體內(nèi)抗菌實驗中,化合物44在感染后給藥(治療給藥)的模式中依然能表現(xiàn)出良好的抗菌藥效,這也為后續(xù)的臨床前開發(fā)提供了更有說服力的藥效數(shù)據(jù)。本部分工作發(fā)現(xiàn)的化合物化合物44,具有更優(yōu)的藥物安全性、更合理的體內(nèi)抗菌效果,可以作為靶向細菌致病力的抗耐藥菌候選藥物進一步深入開發(fā)。
[Abstract]:This paper consists of two parts : the first part is the research of the non - reversible inhibitor of subtype selective pyruvate dehydrogenase kinase . The metabolic abnormality of cancer cells is one of the characteristics of tumor cell survival and proliferation . In order to explain the inhibitory activity of these derivatives on PDK1 , it was found that the inhibitory effect of these derivatives on PDK1 was better than that of PDK1 - 4 . The results showed that the inhibition of PDK1 was better than that of pacts / Ki ( second - order rate constant of target inactivation ) . In this paper , we found that there was no significant negative effect on the body weight of the experimental animals , which was obviously better than that of the drug resistant Staphylococcus aureus . The results showed that the compound 44 had the strongest inhibitory activity against the drug resistance . The results show that the compound 44 not only maintains the antibacterial activity of the leading compound C13 in vivo , but also greatly improves the potential cardiotoxicity caused by the inhibition . In the newly designed mouse body antibacterial experiment , the compound 44 has better drug safety and more reasonable in vivo antibacterial effect , and can be further developed as an anti - drug resistant candidate drug for targeting bacterial virulence .

【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R979.1

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