本文關(guān)鍵詞：殼聚糖磁性溫敏凝膠作為絲裂霉素載體改善膀胱腫瘤灌注治療的研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景膀胱癌是人類泌尿生殖系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,隨著人口總體老齡化,霧霾等空污染加重,工廠的致癌物質(zhì)以及煙草的濫用等因素的潛在影響,膀胱癌的總體發(fā)病率在逐年攀升。中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,2015年有80500例患者確診膀胱癌,32900例死于膀胱癌。其中,非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)約占膀胱腫瘤的80%,雖然經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(Transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是治療 NMIBC 的金標(biāo)準(zhǔn),但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率在50～70%,因此,對(duì)NMIBC患者術(shù)后輔以膀胱灌注治療以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。紋裂霉素(Mitomycin C,MMC)可以通過(guò)破壞細(xì)胞DNA復(fù)制以及蛋Qg質(zhì)合成發(fā)揮抗腫瘤活性,價(jià)格低廉,且灌注療效與其他抗腫瘤藥物無(wú)明顯差異,性價(jià)比高,是臨床中常用的膀胱灌注化療藥物。然而傳統(tǒng)的MMC膀胱灌注化療療效有限,平均降低膀胱腫瘤復(fù)發(fā)率僅約14～17%,而且部分患者膀胱腫瘤甚至發(fā)生進(jìn)展。這些不足主要?dú)w因于傳統(tǒng)的膀胱灌注化療方式。部分患者難以忍受MMC對(duì)膀胱黏膜的刺激,藥物在膀胱內(nèi)保留不足2h;也存在部分患者對(duì)MMC不敏感,雖然能保留MMC2h,但是隨著尿液的產(chǎn)生,不僅稀釋了 MMC濃度,而且過(guò)多的尿液促使周期性排尿,并不能保留MMC過(guò)多時(shí)間。為提高灌注療效,單純?cè)黾覯MC濃度又會(huì)使副作用更凸顯�？偟膩�(lái)說(shuō),傳統(tǒng)膀胱灌注方式使得藥液在膀胱內(nèi)滯留時(shí)間有限,作用時(shí)間較短,不能使時(shí)間、濃度依賴性的MMC有效的發(fā)揮抗腫瘤活性。多項(xiàng)新技術(shù)用于研究改善膀胱灌療效,如藥物聯(lián)合透明質(zhì)酸、二甲基亞砜灌注,可以提高藥物在膀胱黏膜的吸收;化學(xué)熱療法或電化學(xué)方法也有報(bào)道用于膀胱灌注,以改善藥物通透能力;光動(dòng)力學(xué)治療在膀胱灌注中也有潛在的優(yōu)點(diǎn)。然而,以上新技術(shù)存在諸多缺點(diǎn),如療效欠佳,化學(xué)毒性,價(jià)格昂貴等,限制了其在膀胱灌注中的應(yīng)用。近年來(lái),利用藥物載體增加藥物濃度梯度、延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間以及進(jìn)行靶向治療是醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在筆者的前期實(shí)驗(yàn)中,成功制備了具有磁性和溫敏特性的凝膠載體系統(tǒng)。該系統(tǒng)是一種特殊的原位成型沉淀(In situ forming depot,ISFD)系統(tǒng),由殼聚糖(chitosan,CS),β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,GP),Fe3O4 磁性納米顆粒(Fe3O4magnetic nanoparticle,Fe3O4-MNP)組成,其最突出的特性是在制備完成時(shí)為液體,而在體溫環(huán)境下,則能迅速轉(zhuǎn)化為凝膠固體,形成藥物的暫時(shí)儲(chǔ)存?zhèn)}庫(kù),黏附于周圍組織。而且,該載體系統(tǒng)具有良好的生物相容性,生物降解性,生物黏附性,無(wú)毒性,藥物緩釋、控釋,靶向等特性,是局部藥物投送載體中最有前途的候選者。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),裝載胰島素的溫敏凝膠系統(tǒng)注射入大鼠皮下后,可以緩釋胰島素超過(guò)5天。磁性載體搭載阿霉素灌注進(jìn)入豬膀胱內(nèi),在外加磁場(chǎng)的牽引下,可以靶向治療膀胱腫瘤,并且藥物滯留時(shí)間較傳統(tǒng)灌注方式明顯延長(zhǎng)。因此,筆者設(shè)想,磁性溫敏凝膠載體系統(tǒng)或許可以用來(lái)改善傳統(tǒng)膀胱灌注化療方式,延長(zhǎng)MMC在膀胱內(nèi)作用時(shí)間,提高抗腫瘤活性,降低術(shù)后膀胱腫瘤復(fù)發(fā)率。研究目的本研究首先制備載藥磁性溫敏凝膠系統(tǒng)(Fe3O4-MMC-CS/GP),進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn),并與MMC傳統(tǒng)膀胱灌注化療進(jìn)行比較,明確該載藥體系是否能提高M(jìn)MC膀胱灌注抗腫瘤療效;同時(shí)對(duì)該體系的凝膠轉(zhuǎn)化、磁響應(yīng)性、微觀表征、溶脹性、降解性、藥物釋放特性、滯留能力等進(jìn)行研究,以明確其增強(qiáng)MMC灌注化療抗腫瘤活性的原理和機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法1.體外實(shí)驗(yàn)部分1.1載藥磁性溫敏凝膠系統(tǒng)(Fe3O4-MMC-CS/GP)的構(gòu)建及磁響應(yīng)性檢測(cè)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及筆者的前期實(shí)驗(yàn),將Fe3O4-MMC-CS/GP制備方法簡(jiǎn)述如下:1)將一定量的CS溶于0.1mol/L的稀鹽酸中,室溫下磁力攪拌2h,過(guò)濾掉其中不溶性顆粒;2)蒸餾水溶解一定量的GP;3)將上述兩種溶液置于冰浴中10min(或4℃冰箱中儲(chǔ)存1Omin);4)在冰浴、CS溶液持續(xù)攪拌狀態(tài)下,將GP溶液逐滴滴加入CS溶液中,直至形成均一透明溶液;5)在混合溶液中加入Fe3O4-MNP及MMC,通過(guò)超聲分散或機(jī)械攪拌混勻。取小塊凝膠置于盛蒸餾水的燒杯中,在外置磁鐵的情況下,觀察凝膠的磁響應(yīng)性。1.2 Fe3O4-MMC-CS/GP體外凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間檢測(cè)及影響因素凝膠化時(shí)間采用經(jīng)典的試管倒置法進(jìn)行檢測(cè)。在前期研究中,筆者已經(jīng)明確,不同的CS和GP配比會(huì)影響凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間,本研究中采用凝膠轉(zhuǎn)化速度最快的CS/GP配比,用不同分子量(Molecular weight,Mw)和小同脫乙酸度(Deacetylation degree,DD)的CS在不同溫度下進(jìn)行凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間檢測(cè),研究此三種因素對(duì)Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間的影響。1.3 Fe3O4-MMC-CS/GP體外藥物釋放檢測(cè)采用透析法對(duì)Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠系統(tǒng)進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn),明確其藥物釋放行為特點(diǎn),并與傳統(tǒng)膀胱灌注相比較。將適量的載藥凝膠置于透析袋中,然后放入盛有溶出介質(zhì)的燒杯中,37℃恒溫水浴搖床,溶出介質(zhì)每2h更換一次,以模擬排尿周期,收集的溶出樣本過(guò)濾后-80℃儲(chǔ)存,等待批量檢測(cè)。MMC濃度檢測(cè)采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后繪制濃度-時(shí)間曲線,釋放總量時(shí)間曲線,并計(jì)算藥時(shí)曲線下而積(Area under the curve,AUC),并與傳統(tǒng)膀胱灌注比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,同時(shí)研究CS分子量,Fe304-MNP以及載藥量對(duì)該載藥系統(tǒng)藥物釋放的影響。1.4掃描電子顯微鏡及數(shù)碼顯微鏡檢測(cè)Fe304-MMC-CS/GP凝膠表征Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠化后凍干,取少量樣品,噴金增加導(dǎo)電性,置于掃描電子顯微鏡(Scanning electronmicroscope,SEM)下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)并進(jìn)行分析;取適量凝膠制作冰凍切片,然后行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色,置于數(shù)碼顯微鏡下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)并拍攝數(shù)碼照片。1.5溶脹及降解檢測(cè)為檢測(cè)Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠吸水溶脹及儲(chǔ)藥能力,評(píng)估體內(nèi)應(yīng)用安全性及降解速率,采用重量分析法檢測(cè)其溶脹率及降解速率。溶脹實(shí)驗(yàn):稱量一定量的干凝膠,放入PBS中,間隔一定時(shí)間取出凝膠,濾紙擦干表面水分,稱量濕重,計(jì)算溶脹率。分析Fe3O4-MNP及MMC對(duì)凝膠溶脹的影響。體外降解實(shí)驗(yàn):稱量一定量的干凝膠,放入PBS緩沖液中,37℃水浴搖床,每天記錄凝膠干重,并更換PBS緩沖液,計(jì)算降解速率。分析溶菌酶、Fe3O4-MNP及MMC對(duì)凝膠載體系統(tǒng)降解的影響。1.6 Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠系統(tǒng)體外抗腫瘤細(xì)胞活性檢測(cè)明確Fe3O4-MMC-CS/GP對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響,并與傳統(tǒng)MMC膀胱灌注比較抗腫瘤療效,采用CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。96孔板接種T24細(xì)胞后分為5組,分別接受不同處理,組1:空白對(duì)照組,無(wú)特殊處理;組2:外加磁場(chǎng);組3:外加磁場(chǎng)+Fe3O4-CS/GP凝膠;組4:外加磁場(chǎng)+MMC溶液;組5:外加磁場(chǎng)+Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠。每2h更換培養(yǎng)基,模擬周期性排尿。處理24h后加入CCK-8試劑進(jìn)行光密度(Optical density,OD)值測(cè)量。比較Fe3O4-MMC-CS/GP與傳統(tǒng)膀胱灌注MMC溶液抗腫瘤細(xì)胞活性的差異。1.7 Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡檢測(cè)因MMC主要通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)起到抗腫瘤作用,因此筆者采用流式細(xì)胞儀來(lái)分析Fe3O4-MMC-CS/GP對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,并與MMC溶液的凋亡誘導(dǎo)相比較。T24細(xì)胞接種6孔板,分組處理如實(shí)驗(yàn)1.6所述。24h后收集處理細(xì)胞,用Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分2.1 Fe3O4-MMC-CS/GP體內(nèi)滯留實(shí)驗(yàn)為明確磁性凝膠載體系統(tǒng)是否能延長(zhǎng)MMC灌注后在膀胱腔內(nèi)存留時(shí)間,筆者用雌性大鼠進(jìn)行了體內(nèi)滯留實(shí)驗(yàn)。新鮮配制Fe3O4-MMC-CS/GP體系液體溶液,用自制3F導(dǎo)尿管對(duì)27只雌性Wistar大鼠進(jìn)行膀胱灌注,每只大鼠灌注0.1ml。灌注治療完成后的大鼠置于0.4T磁場(chǎng)的環(huán)境中飼養(yǎng)。灌注后在2,4,6,8,10,12,24,48,72h分別處死3只大鼠,解剖取出大鼠膀胱,做冰凍切片后行HE染色,觀察灌注后不同時(shí)間點(diǎn)Fe3O4-MMC-CS/GP在膀胱內(nèi)的存留情況。2.2 Fe3O4-MMC-CS/GP體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證、分析MMC從磁性凝膠載體中釋放的規(guī)律,筆者用Wistar大鼠進(jìn)行Fe3O4-MMC-CS/GP的體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)。雌性Wistar大鼠麻醉后,導(dǎo)尿排空膀胱,實(shí)驗(yàn)組灌注0.1ml的Fe304-MMC-CS/GP溶液(含0.1mg的MMC),對(duì)照組灌注0.1ml的MMC溶液(同樣含0.lmg的MMC)。灌注后將大鼠置于0.4T磁場(chǎng)的代謝籠中,并開始收集2,4,6,8,10,12,24,48,72h時(shí)間段內(nèi)的尿液,過(guò)濾后置于-80℃,等待HPLC批量檢測(cè)MMC濃度,繪制濃度-時(shí)間曲線,MMC釋放量-時(shí)間曲線,計(jì)算AUC,分析Fe3O4-MMC-CS/GP藥物緩釋行為,并與傳統(tǒng)MMC灌注相比較。2.3 Fe3O4-MMC-CS/GP膀胱灌注體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)分析并比較Fe304-MMC-CS/GP與傳統(tǒng)MMC膀胱灌注體內(nèi)抗腫瘤療效。32只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組。所有大鼠在成瘤期正常飲食,于飲水中添加BBN喂養(yǎng)8周。10周后所有大鼠進(jìn)入膀胱灌注治療期,組1灌注PBS,組2灌注Fe3O4-CS/GP,組3灌注MMC溶液,組4灌注Fe3O4-MMC-CS/GP。所有大鼠每周灌注1次,共6周。組2、4給予外加磁場(chǎng)處理。20周后處死所有大鼠,解剖留取大鼠膀胱、雙側(cè)輸尿管及雙腎,統(tǒng)計(jì)各組大鼠膀胱內(nèi)腫瘤大小及數(shù)量并進(jìn)行對(duì)比分析。2.4生存率評(píng)估為進(jìn)一步評(píng)價(jià)Fe3O4-MMC-CS/GP膀胱灌注抗腫瘤療效以及對(duì)生存率的影響,從膀胱灌注治療期開始,統(tǒng)計(jì)各組大鼠生存率及死亡率,并繪制生存曲線,比較各組大鼠生存率差異。2.5免疫組織化學(xué)評(píng)估腫瘤凋亡膀胱腫瘤在MMC的作用下出現(xiàn)凋亡,是MMC抗膀胱腫瘤的重要作用機(jī)制。為進(jìn)一步對(duì)比分析Fe3O4-MMC-CS/GP與單純MMC溶液的體內(nèi)抗腫瘤作用強(qiáng)弱,用免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)分析各組大鼠腫瘤的凋亡情況。將各組大鼠膀胱腫瘤放入4%多聚甲醛中固定24h,石蠟包埋后切片,采用cleaved caspase-9和cleaved caspase-3抗體免疫組化染色的方法評(píng)估各組大鼠膀胱腫瘤的凋亡強(qiáng)弱。2.6統(tǒng)計(jì)分析使用Graphpad Prism 5.0對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)數(shù)據(jù)類型選用單因素方差分析、Fisher卡方檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)研究中計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,選用雙側(cè)檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1載藥磁性溫敏凝膠(Fe304-MMC-CS/GP)構(gòu)建成功并具有良好的磁響應(yīng)性筆者用磁性溫敏凝膠成功裝載了 MMC,室溫下該體系為流動(dòng)的液體,性質(zhì)均一,呈黑色,有一定的黏度,流動(dòng)性好。加熱至37℃時(shí),該體系迅速由液體轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w,呈凝膠狀,性質(zhì)均一,質(zhì)地略柔軟,不易變形,但施加強(qiáng)作用力后可破裂。取小塊Fe304-MMC-CS/GP凝膠置于盛水的燒杯中,在外加磁場(chǎng)的作用下,凝膠迅速移動(dòng)并吸附于燒杯壁上,表現(xiàn)出良好的磁響應(yīng)性。1.2 Fe3O4-MMC-CS/GP體外凝膠化時(shí)間檢測(cè)及影響因素筆者測(cè)試了 3種Mw以及2種DD的CS在不同溫度下的凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間,結(jié)果顯示Mw、DD以及溫度均可以影響Fe3O4-MMC-CS/GP由液體轉(zhuǎn)化為固體凝膠的速率。在同一溫度下,隨著Mw的增加,DD的升高,凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間明顯縮短;同一種CS配制的Fe3O4-MMC-CS/GP體系,在較高溫度時(shí),凝膠轉(zhuǎn)化時(shí)間有所縮短。1.3 Fe3O4-MMC-CS/GP具有良好的緩釋藥物特性Fe3O4-MMC-CS/GP在溶出介質(zhì)中持續(xù)釋放MMC,2h藥物濃度達(dá)峰值,此后藥物濃度逐漸下降,呈現(xiàn)出先快后慢的釋放趨勢(shì)。藥物體外持續(xù)釋放時(shí)間約24h,而且突釋濃度顯著降低(75.33 ±0.85μg/ml,較對(duì)照組下降23.48%)。對(duì)照組模擬傳統(tǒng)膀胱灌注,單純MMC溶液濃度在前2h保持最高,突釋強(qiáng)(98.44± 0.52 μg/ml),更換溶出介質(zhì)后,濃度為0,且此后無(wú)MMC繼續(xù)釋放。兩者AUC無(wú)明顯差異。因此Fe304-MMC-CS/GP凝膠具有良好的緩釋藥物作用,可以持續(xù)釋放MMC,抗腫瘤作用時(shí)間明顯長(zhǎng)于傳統(tǒng)膀胱灌注。Mw以及MMC含量會(huì)輕微影響凝膠載體系統(tǒng)的緩釋行為,但不顯著,Fe3O4-MNP對(duì)藥物釋放幾乎無(wú)影響。1.4掃描電鏡及數(shù)碼顯微鏡檢測(cè)Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠表征掃描電鏡下觀察凍干CS/GP凝膠,可以觀察到凝膠成疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),孔徑大小比較均一,基質(zhì)表面光滑;Fe3O4-MMC-CS/GP同樣呈現(xiàn)疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),但基質(zhì)表面呈粗糙的顆粒狀,因MMC及Fe3O4-MNP黏附或包埋于基質(zhì)表面及內(nèi)部而產(chǎn)生。數(shù)碼顯微鏡觀察凝膠冷凍切片,凝膠因HE染色呈現(xiàn)紅色,同樣為疏松多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),性質(zhì)均一,可見(jiàn)黑色的Fe3O4-MNP顆粒,高倍鏡下可觀察到藍(lán)色的MMC顆粒。載藥體系的微觀表征,有利于液體進(jìn)入凝膠內(nèi)部,使裝載的藥物得以溶出,并被運(yùn)送至凝膠外,產(chǎn)生藥物釋放行為。1.5 Fe3O4-MMC-CS/GP具有良好的溶脹及降解特性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,在PBS溶液中,CS/GP與Fe3O4-MMC-CS/GP干凝膠會(huì)在1h內(nèi)迅速溶脹,幾乎達(dá)峰值,溶脹率分別為255.19%±16.02%和196.64%±22.63%,因此該凝膠系統(tǒng)有著良好的吸水能力,有利于MMC的溶出、暫時(shí)儲(chǔ)存及緩釋。Fe3O4-MMC-CS/GP的溶脹率略低,主要是由于MMC及Fe3O4-MNP占據(jù)了凝膠內(nèi)部部分空間,導(dǎo)致吸水量相對(duì)減少所致。體外降解實(shí)驗(yàn)顯示,在不含溶菌酶的PBS溶液中,CS/GP與Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠降解緩慢,10天約降解了20%,而在含溶菌酶的PBS溶液中,兩種凝膠系統(tǒng)降解速度明顯加快,10天降解了約80%,可以預(yù)測(cè)該凝膠系統(tǒng)在體內(nèi)有著良好的生物降解性。1.6 Fe3O4-MMC-CS/GP體外抗腫瘤細(xì)胞活性較單純MMC溶液更強(qiáng)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在中、低劑量 MMC實(shí)驗(yàn)中,單純MMC溶液處理以及Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠處理后,其 OD值明顯低于不含MMC處理的前3組,且Fe3O4-MMC-CS/GP處理組的OD值要低于單純MMC溶液處理組的 OD 值(中劑量組:0.537 ±0.009 vs.0.323 ± 0.003,P= 0.00070.001;低劑量組:1.727 ±0.029 vs.0.626 ±0.010,P=0.00030.001),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示Fe3O4-MMC-CS/GP體外抗膀胱癌細(xì)胞活性更強(qiáng)。在高劑量MMC實(shí)驗(yàn)中,雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但Fe3O4-MMC-CS/GP的OD值仍低于單純MMC溶液處理組。1.7 Fe304-MMC-CS/GP凝膠體外誘導(dǎo)更多腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)結(jié)果顯示,單純MMC處理以及Fe304-MMC-CS/GP處理組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增加,明顯高于不含MMC處理的前3組,且Fe3O4-MMC-CS/GP組凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著多于MMC處理組,分別為27.33%±4.51%和10.20%± 2.80%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示相同條件下Fe304-MMC-CS/GP凝膠誘導(dǎo)更多T24腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。2.1 Fe3O4-MMC-CS/GP在膀胱內(nèi)具有強(qiáng)大的滯留特性通過(guò)留取不同時(shí)間點(diǎn)的人鼠膀胱組織,切片后HE染色觀察發(fā)現(xiàn),灌注后的Fe3O4-MMC-CS/GP混合溶液在膀胱腔內(nèi)形成凝膠并黏附于膀胱壁,隨著時(shí)間的流逝,Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠在腐蝕、酶解等作用下質(zhì)量逐漸減少,灌注后72h留取的大鼠膀胱中,仍可以觀察到少量的凝膠黏附于膀胱壁,且高倍鏡下可見(jiàn)凝膠中的MMC顆粒。提示Fe3O4-MMC-CS/GP體內(nèi)滯留時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)72h。2.2 Fe3O4-MMC-CS/GP體內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)釋放試驗(yàn)顯示,Fe3O4-MMC-CS/GP凝膠在大鼠膀胱腔內(nèi)釋放MMC長(zhǎng)達(dá)72h,與單純MMC溶液灌注相比,延長(zhǎng)了約17倍,半衰期增加至5.34±1.67h。從釋放行為上看,Fe3O4-MMC-CS/GP的緩釋作用使MMC釋放更加平穩(wěn),釋放時(shí)間延長(zhǎng),無(wú)明顯藥物突釋。藥時(shí)曲線下面積結(jié)果顯示,Fe3O4-MMC-CS/GP較傳統(tǒng)單純MMC灌注有著更明顯的優(yōu)勢(shì)(418.70±12.79 vs.191.70± 57.45,P=0.01820.05),生物利用度增加了 118.41%。不僅如此,MMC作用時(shí)間延長(zhǎng),導(dǎo)致通過(guò)膀胱黏膜吸收的MMC量增加了 172.44%。2.3 Fe304-MMC-CS/GP體內(nèi)抗腫瘤活性較傳統(tǒng)MMC灌注更強(qiáng)4組大鼠經(jīng)過(guò)成瘤期,膀胱灌注治療期結(jié)束后,全部處死,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,組1、組2中所有大鼠均存在膀胱腫瘤,且腫瘤體積較大,基底寬,活動(dòng)度差,部分腫瘤表面出現(xiàn)白色鈣化沉淀,兩組中均存在腫瘤侵及輸尿管引起梗阻,致同側(cè)輸尿管、腎擴(kuò)張積水的大鼠病例。組3(MMC)、組4(Fe304-MMC-CS/GP)的膀胱腫瘤體積較小,且組4中的平均腫瘤體積明顯小于組3(3.30±0.56 mm3 vs.5.88 ±0.65 mm3,P = 0.0083),抑制腫瘤體積生長(zhǎng)43.88%。但成瘤大鼠的膀胱內(nèi)平均腫瘤數(shù)目上無(wú)明顯差異。2.4 Fe3O4-MMC-CS/GP灌注治療組大鼠具有最高的生存率4組大鼠從膀胱灌注治療期開始觀察統(tǒng)計(jì)生存、死亡數(shù)目,并繪制生存曲線,至20周時(shí)結(jié)束。結(jié)果顯示,組1、組2中因終點(diǎn)事件死亡大鼠數(shù)目分別為5 只和4只,MMC灌注組因終點(diǎn)事件死亡大鼠1只,Fe3O4-MMC-CS/GP灌注組無(wú)終點(diǎn)事件出現(xiàn)。因此,組4生存率較其他三組高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.02610.05)。2.5免疫組織化學(xué)評(píng)估腫瘤凋亡4組大鼠膀胱腫瘤經(jīng)免疫組化染色顯示,cleaved caspase-3在組1、組2中染色較淺,表達(dá)較低,而經(jīng)過(guò)MMC及Fe3O4-MMC-CS/GP治療的組3、組4中,表達(dá)增高。經(jīng)軟件Image-Pro Plus 6.0處理后統(tǒng)計(jì)各組切片每個(gè)視野組織面積(Area)及積分光密度值(IOD),并計(jì)算IOD/Area,結(jié)果提示組4中cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)明顯高于組 3(159.64± 14.95 vs68.32± 14.31,P0.0001),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示組4中腫瘤細(xì)胞凋亡更明顯。cleaved caspase-9是caspase-3上游caspase-9的活化形式,表達(dá)趨勢(shì)與cleaved caspase-3相同,同樣提示組4中更多腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)研究中,筆者成功將MMC與磁性溫敏凝膠載體相結(jié)合,制備了一種新型的膀胱灌注系統(tǒng)Fe3O4-MMC-CS/GP。該系統(tǒng)具有良好的磁響應(yīng)性,在室溫下為流動(dòng)的液體,灌注進(jìn)入膀胱后能迅速轉(zhuǎn)化為凝膠,黏附于膀胱壁或在外加磁場(chǎng)引導(dǎo)下黏附于靶點(diǎn)。該凝膠系統(tǒng)具有無(wú)毒性、良好的組織相容性及生物降解性,體內(nèi)、體外均緩慢釋放MMC,并且延長(zhǎng)MMC在膀胱內(nèi)的滯留時(shí)間,增加膀胱黏膜對(duì)MMC的吸收,與傳統(tǒng)膀胱灌注相比,具有更好的抗腫瘤細(xì)胞活性,能誘導(dǎo)更多的腫瘤細(xì)胞凋亡,提高膀胱腫瘤大鼠模型的存活率。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾敬;貝翠翠;梁爽;董卓;代鑫;婁陽(yáng);王彤;辛興;;殼聚糖基水凝膠的制備及溶脹性能研究[J];沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2016年03期

2 易文清;李新法;陳金周;牛明軍;;殼聚糖水凝膠微球的制備與溶脹性能[J];功能高分子學(xué)報(bào);2010年04期

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本文編號(hào)：1423806