本文關(guān)鍵詞：H6R6短肽修飾的殼聚糖納米粒用于siRNA的遞送及其在腫瘤治療中的應(yīng)用　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：近年來,基因療法已成為癌癥治療的重要手段之一,其中,小干擾RNA(siRNA)藥物已受到醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛關(guān)注。但是,siRNA藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性差、易被核酸酶降解,半衰期短,這些缺陷限制了 siRNA的臨床應(yīng)用。因此,發(fā)展能夠高效遞送siRNA藥物的載體已成為本領(lǐng)域急需解決的難題。本課題構(gòu)建了能夠高效遞送siRNA的非病毒載體,并應(yīng)用篩選出的載體加載siRNA制備納米粒,進(jìn)行體內(nèi)外抗腫瘤的研究。首先,將6-聚精氨酸-6-聚組氨酸(H6R6)短肽偶聯(lián)到殼聚糖高分子鏈游離氨基末端,制備H6R6-CS共聚物作為siRNA遞送載體,并利用1H-NMR分析方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。然后選用不同類型的細(xì)胞,通過MTT方法對H6R6-CS共聚物進(jìn)行細(xì)胞毒性評價,研究結(jié)果表明,合成的H6R6-CS共聚物安全無毒。采用酸堿滴定法考察H6R6-CS共聚物的緩沖能力,發(fā)現(xiàn)其在pH3.5-6.5之間存在明顯緩沖能力。以復(fù)凝聚法制備載siRNA的納米粒,并對其表面形態(tài)、粒徑、Zeta電位、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行考察,結(jié)果顯示所制備的納米粒的平均粒徑在175nm左右,Zeta電位在+14.8mV左右、粒徑分布范圍較窄,納米粒呈圓球狀,且表面光滑。選擇能夠穩(wěn)定表達(dá)Luciferase基因的4T1細(xì)胞,考察H6R6短肽修飾后的納米粒對內(nèi)源基因的表達(dá)的抑制情況,研究結(jié)果表明,其抑制率可達(dá)50%。同時利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡法考察納米粒的入胞情況,利用激光共聚焦法考察了納米粒的溶酶體逃逸能力,研究結(jié)果表明,H6R6短肽修飾后的納米粒被腫瘤細(xì)胞的攝取率顯著增強(qiáng),并在轉(zhuǎn)染6h后,能迅速逃離溶酶體。選擇靶向Survivin和BRAF基因的功能性siRNA制備納米粒,研究納米粒對4T1和A375兩種腫瘤細(xì)胞的體外殺傷效果。研究結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染48h后,兩種納米粒抑制細(xì)胞增殖的效率達(dá)到最大,分別為49%和51%。細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果表明:修飾后的納米粒能夠顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。選擇靶向Survivin和BRAF基因的功能性siRNA制備納米粒,研究納米粒對乳腺癌和黑色素瘤的抑制效果。研究結(jié)果顯示:H6R6-CS/siRNASur納米粒能夠顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移,并能有效延長荷瘤小鼠的生存周期。此外,選擇靶向BRAF基因的功能性siRNA制備納米粒,對荷瘤裸鼠進(jìn)行瘤內(nèi)注射觀察其對黑色素瘤的抑制情況,研究結(jié)果顯示:H6R6-CS/siRNABRAF納米粒對黑色素瘤同樣具有顯著抑制作用。
[Abstract]:In recent years, gene therapy has become one of the important means of cancer treatment, among which, small interference RNA-siRNAs have been widely concerned in the field of medicine. SiRNA drugs have poor stability in vivo, are easily degraded by nuclease, and have a short half-life. These defects limit the clinical application of siRNA. The development of efficient delivery of siRNA drug vectors has become an urgent problem in this field. In this paper, a non-viral vector which can efficiently deliver siRNA has been constructed. The nanoparticles were prepared by loading siRNA with the selected carriers, and the anti-tumor effect was studied in vitro and in vivo. First of all. The short peptide of 6-arginine-6-polyhistidine (H6R6) was coupled to the free amino terminal of chitosan polymer chain to prepare H6R6-CS copolymers as siRNA delivery carrier. The structure of H6R6-CS copolymers was identified by 1H-NMR, and the cytotoxicity of H6R6-CS copolymers was evaluated by MTT method. The synthesized H6R6-CS copolymer was safe and non-toxic. The buffer capacity of H6R6-CS copolymer was investigated by acid-base titration. It was found that there was an obvious buffer between pH3.5-6.5 and siRNA nanoparticles were prepared by complex coacervation, and the surface morphology, particle size and Zeta potential of the nanoparticles were investigated. The results showed that the average particle size was about 175 nm and Zeta potential was about 14.8 MV, and the particle size distribution was narrow. The nanoparticles were spherical and smooth. 4T1 cells which could stably express Luciferase gene were selected to investigate the inhibition of endogenous gene expression by H6R6 short peptide modified nanoparticles. The results showed that the inhibition rate could reach 50%. At the same time, flow cytometry and laser confocal microscopy were used to investigate the entry of nanoparticles, and the ability of lysosome escape of nanoparticles was investigated by laser confocal method. The results showed that the uptake rate of H6R6 short peptide modified nanoparticles was significantly increased by tumor cells and was transfected for 6 h. Survivin and BRAF gene targeting functional siRNA were selected to prepare nanoparticles. To study the killing effect of nanoparticles on 4T1 and A375 tumor cells in vitro. The results showed that after 48 hours of transfection, the efficiency of inhibition of proliferation of 4T1 and A375 tumor cells was the highest. The apoptotic results showed that:. The modified nanoparticles could significantly induce apoptosis of tumor cells. The functional siRNA targeting Survivin and BRAF genes was selected to prepare the nanoparticles. To study the inhibitory effect of the nanoparticles on breast cancer and melanoma, the results showed that: H6R6-CSR / siRNASur nanoparticles could significantly inhibit tumor growth and metastasis in tumor-bearing mice. In addition, the functional siRNA targeting the BRAF gene was selected to prepare the nanoparticles, and the tumor bearing nude mice were injected intratumoral to observe the inhibition of melanoma. The results showed that BRAF nanoparticles had significant inhibitory effect on melanoma.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R943;R96

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