本文關鍵詞：Fbxw7通過泛素化蛋白酶解YAP誘導肝癌細胞凋亡和生長停滯　出處：《西安交通大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景:原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我國最常見的惡性腫瘤之一,病死率在各種癌癥病死率中居第2位,其中肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占PLC的90%以上。HCC發(fā)病率逐年升高,隨著高危人群篩查、肝移植技術的成熟、影像學早期診斷以及經動脈化療栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)、射頻消融(Radiofrequency ablation,RFA)和索拉菲尼(Sorafenib)等輔助治療的臨床應用,HCC患者的預后較前已經有了明顯的改善,但總體上還未取得令人滿意的療效。分子靶向藥物索拉菲尼的臨床應用彌補了晚期HCC患者治療手段的空缺,因此,進一步明確HCC發(fā)生發(fā)展涉及的精確分子機制,探索HCC早期診斷分子標志物、設計有效的腫瘤治療分子靶點以及患者預后指示標志物,對提高我國肝癌的治療水平和改善腫瘤患者預后具有重要意義。泛素介導的蛋白質降解通路是基因和蛋白質功能的主要調節(jié)者和終結者,控制著真核細胞內絕大多數蛋白質的降解,因此,對該通路的調控已成為疾病治療中的一種創(chuàng)新性方法。F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)類泛素連接酶E3復合體中特異性識別底物的關鍵因子,能夠靶向泛素化降解 CyclinE,c-Myc,c-Jun,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和 Notch等癌蛋白,從而抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡并增加化療敏感性。研究表明Fbxw7在多種惡性腫瘤中表達缺失,其低表達與患者不良預后密切相關,是一種廣泛的抑癌基因。p53在轉錄水平調節(jié)Fbxw7基因表達,p53-/+Fbxw7-/+基因敲除小鼠和受輻射的Fbxw7-/+小鼠均自發(fā)產生包括HCC在內的多種腫瘤,提示Fbxw7與HCC的發(fā)生發(fā)展存在著某種聯系。Fbxw7的多個靶蛋白如CyclinE,c-Myc,c-Jun和Notch等在HCC中存在表達異常,且與HCC增殖、凋亡、耐藥及不良預后密切相關。Hippo信號通路在哺乳動物中是一個高度保守有效的細胞生長和凋亡調控因子,在許多人類腫瘤特別是HCC中存在該通路的異常,而該通路的核心效應分子是Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鑒定為位于11q22擴增子的一個促癌基因,YAP轉基因小鼠出現肝臟體積明顯增大并最終產生腫瘤,臨床研究發(fā)現YAP是一個與HCC患者無病生存期和總生存期相關的獨立預測因素,提示Hippo-YAP信號通路在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究使用液相色譜-質譜/質譜聯用(Liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)技術分析有絲分裂相關蛋白磷酸化位點,YAP蛋白共鑒定出17條磷酸肽和16個磷酸化位點,其中S131和T141位點[(L)-V-pS-P-(P)-G-pT]包含Fbxw7結合的保守 CDC4 磷酸決定子(CDC4 phospho-degron,CPD)序列[(L)-X-pT/pS-P-(P)-X-pS/pT/E/D],提示YAP可能是Fbxw7潛在的靶蛋白。Fbxw7在HCC中是否表達異常?是否與HCC臨床病理特征相關?其表達變化是否影響HCC的增殖及凋亡?確切的分子機制是否涉及Hippo-YAP信號通路?目前尚不清楚。目的:本實驗旨在探討Fbxw7在HCC的表達及其對HCC細胞增殖和凋亡的影響,研究Fbxw7在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用,并初步探討其可能的分子機制,為尋找HCC新的治療靶點奠定基礎。方法:1.應用免疫組化染色、Western blot和qRT-PCR檢測Fbxw7在HCC及對應癌旁組織中的表達,分析Fbxw7與HCC臨床病理特征的相關性。2.應用qRT-PCR鑒定Fbxw7 mRNA在永生化人肝細胞系L02和HCC細胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402 及 Huh7 的表達水平。3.應用逆轉錄病毒介導的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分別轉染HepG2和Hep3B細胞,qRT-PCR和Western blot檢測Fbxw7表達變化,流式細胞術、Caspase3/7活性分析、BrdU細胞增殖分析和MTT法檢測細胞增殖和凋亡變化。4.應用免疫組化染色檢測YAP在HCC及對應癌旁組織中的表達,分析YAP與Fbxw7蛋白蛋白表達相關性。5.應用 Flag-Fbxw7 和 Fbxw7 shRNA 分別轉染 HepG2 和 Hep3B 細胞,qRT-PCR、Western blot和免疫熒光染色檢測YAP表達變化。6.HEK293細胞共轉染Flag-Fbxw7和HA-YAP,免疫共沉淀檢測Fbxw7與YAP之間的相互作用;Flag-Fbxw7轉染過表達HA-YAP的HepG2細胞,免疫共沉淀檢測YAP蛋白泛素化水平變化;CHX追蹤分析檢測Fbxw7過表達對HepG2細胞中YAP蛋白半衰期的影響。7.HA-YAP 轉染 Fbxw7 過表達的 Hep3B 細胞,Western blot 檢測 Fbxw7 和 YAP 蛋白表達變化,流式細胞術、Caspase3/7活性分析、BrdU細胞增殖分析和MTT法檢測細胞增殖和凋亡變化。8.分別應用穩(wěn)定轉染EV、Flag-Fbxw7及Flag-Fbxw7+HA-YAP的Hep3B細胞構建裸鼠皮下種植瘤模型,繪制腫瘤生長曲線;免疫組化和TUNEL技術檢測各組瘤體標本中YAP、Ki-67和凋亡變化。結果:1.Fbxw7在HCC組織中的表達水平顯著低于對應癌旁組織(P0.01);Fbxw7蛋白在較大腫瘤體積(≥5cm)、血管侵犯、高TNM分期和高病理分級的HCC組織中表達顯著降低(P0.05)。2.所有細胞系中均能檢測到Fbxw7 mRNA表達,其在LO2細胞中表達最高,SMMC-7721細胞中表達最低。3.Fbxw7過表達誘導HepG2細胞凋亡和生長停滯(P0.01);敲低Fbxw7導致Hep3B細胞凋亡抵抗和生長加速(P0.01)。4.YAP在HCC組織中的表達水平顯著高于對應癌旁組織(P0.01);Fbxw7與YAP蛋白表達呈顯著負相關(r=-0.572,P=0.003)。5.在HepG2細胞中過表達Fbxw7不影響YAP mRNA表達,但下調YAP蛋白水平(P0.01);在Hep3B細胞中敲低Fbxw7不影響YAP mRNA表達,但導致YAP蛋白蓄積(P0.01)。6.Fbxw7與YAP蛋白存在相互作用,過表達Fbxw7導致HepG2細胞中YAP蛋白泛素化水平升高且半衰期縮短。7.恢復YAP蛋白表達能夠部分消除Fbxw7誘導的Hep3B細胞體外凋亡和生長阻滯(P0.01)。8.Fbxw7顯著抑制Hep3B細胞體內生長,恢復YAP蛋白表達能部分逆轉Fbxw7對Hep3B細胞的體內凋亡誘導和生長抑制作用(P0.01)。結論:1.Fbxw7低表達與HCC惡性臨床病理特征相關,且Fbxw7與癌蛋白YAP表達呈顯著負相關,Fbxw7可能作為潛在的HCC患者預后指示分子。2.Fbxw7通過泛素化蛋白酶解負向調控YAP蛋白的穩(wěn)定性,YAP可能是Fbxw7的一個新靶蛋白。3.YAP蛋白能部分逆轉Fbxw7對HCC細胞的體內外凋亡誘導和生長抑制作用,Fbxw7可能通過Hippo-YAP信號通路發(fā)揮抑癌功能。
[Abstract]:Background : Primary liver cancer ( PLC ) is one of the most common malignant tumors in China . The mortality of HCC is more than 90 % of PLC . p53 - / + Fbxw7 - / + knockout mice and irradiated Fbxw7 - / + mice spontaneously produce a variety of tumors , including HCC , suggesting that Fbxw7 is associated with the development of HCC . The expression of Fbxw7 mRNA in HCC and HCC cell line HepG2 , Hep3B , 7721 , BEL - 7402 and Huh7 were determined by immunohistochemical staining , Western blot and Western blot . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) .

【學位授予單位】：西安交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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