本文關(guān)鍵詞：sEXPAR-SPR構(gòu)建與膜聯(lián)蛋白A1在HPS相關(guān)的PASMCs炎癥表型及增殖中的作用研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景和目的本課題是結(jié)合臨床檢驗診斷學(xué),危重病醫(yī)學(xué)和外科學(xué)等多學(xué)科共同合作進(jìn)行的臨床相關(guān)疾病的分子機制研究。本課題的主要研究在危重病醫(yī)學(xué)方面,即遠(yuǎn)端器官致肺損傷的基礎(chǔ)和臨床研究。而臨床相關(guān)疾病為肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS),研究其病理生理的分子調(diào)控機制。同時結(jié)合臨床檢驗診斷學(xué),利用固相指數(shù)擴增反應(yīng)(solidoid exponential amplification reaction,sEXPAR)-表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)生物傳感器技術(shù)作為篩選工具,對HPS進(jìn)程相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶點進(jìn)行篩選,這種技術(shù)具有高效、高通量的優(yōu)點。篩選結(jié)果再結(jié)合文獻(xiàn)及前期實驗,可以使研究具有指向性和可操作性,進(jìn)一步揭示HPS的病理生理機制。HPS是一種晚期肝病導(dǎo)致肺內(nèi)微血管發(fā)生一系列病理變化的臨床綜合征。HPS的發(fā)生率在肝病晚期的患者中已經(jīng)大于15%,并且其死亡率呈現(xiàn)增長趨向,因此對HPS的病理生理機制的研究具有重要意義并逐漸成為熱點。肺組織中的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)受到循環(huán)中來自肝臟的刺激因素的作用,使它們發(fā)生肌樣分化并增殖異常導(dǎo)致肺內(nèi)微血管擴張(intrapulmonary vasodilatation,IPVD),肺內(nèi)氧合障礙形成的低氧環(huán)境進(jìn)一步促使血管中層的肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)換并增殖加劇,這些均加重肺血管重建(pulmonary vascular remodelling,PVR),最終促使HPS的發(fā)生發(fā)展。因此,HPS相關(guān)的PVR中包括PMVECs和PASMCs兩種主要細(xì)胞的分化,表型轉(zhuǎn)換和異常增殖等。本課題主要針對PASMCs發(fā)生病理生理變化的分子調(diào)控機制進(jìn)行研究。既往研究報道,在HPS的病理進(jìn)程中,多種細(xì)胞因子進(jìn)入循環(huán),激活多條信號通路,導(dǎo)致PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和異常增殖。這些信號通路彼此交錯,錯綜復(fù)雜,難以完全阻斷,研究需要進(jìn)一步深入。近年對于PASMCs炎癥表型介導(dǎo)機制的研究發(fā)現(xiàn),在低氧性肺動脈高壓等的病理條件下,低氧等刺激因素和多種生長因子可以介導(dǎo)PASMCs的炎癥表型。HPS的發(fā)生發(fā)展中多種細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放,而血管收縮和氧合障礙也進(jìn)一步加重IL-1、IL-6和前列腺素E2(PGE2)等炎性介質(zhì)的釋放。PASMCs發(fā)生炎癥表型,并從G0/G1期重新進(jìn)入細(xì)胞周期,從靜止轉(zhuǎn)化為增殖狀態(tài)。因此PASMCs炎癥表型的變化可能是其發(fā)生其他病理生理變化的前提。基于以上原因,本課題選擇對PVR相關(guān)的PASMCs的炎癥表型和增殖的調(diào)控機制進(jìn)行研究,以期為HPS找到新的基因治療靶點。sEXPAR-SPR生物傳感器檢測技術(shù),是結(jié)合s EXPAR和SPR的新型檢測技術(shù)。SPR生物傳感器是基于光學(xué)物理原理的檢測技術(shù),通過在芯片檢測池或其表面結(jié)合生物大分子以及利用這些生物大分子的相互作用可改變其折射率,從而實現(xiàn)生物大分子的快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡便的檢測。s EXPAR是一種DNA恒溫指數(shù)擴增的方法,通過形成聚合-置換-切開-聚合的循環(huán),從而實現(xiàn)恒溫指數(shù)擴增。通過兩種技術(shù)的結(jié)合,針對檢測目標(biāo)DNA設(shè)計引物及探針,實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的s EXPAR。而SPR的同一芯片不同檢測池可以固定不同探針,從而實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測。微小RNA(miRNA)是約20~24個核苷酸長度的非常保守的單鏈非編碼小RNA。越來越多的文獻(xiàn)表明,miRNA可以作為新的靶點用于疾病的早期診斷或治療。在本研究中,我們擬采用s EXPAR-SPR生物傳感器這一技術(shù)對HPS相關(guān)的PVR中mi RNA的表達(dá)進(jìn)行高通量、高靈敏度的篩查。檢測陽性的mi RNA結(jié)果,其對應(yīng)調(diào)控的靶蛋白可能成為在PASMCs炎癥表型及增殖中具有重要調(diào)控作用的潛在蛋白。膜聯(lián)蛋白A1(Annexin A1,ANXA1)是膜聯(lián)蛋白家族成員之一,是鈣離子依賴的細(xì)胞膜磷脂結(jié)合蛋白。ANXA1在不同的組織和部位發(fā)揮著包括抗炎效應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能。通過sEXPAR-SPR生物傳感器技術(shù)的篩選,我們發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p在HPS組中表達(dá)明顯上調(diào)并具有統(tǒng)計學(xué)意義,而通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)其可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制調(diào)節(jié)ANXA1的表達(dá)。結(jié)合既往研究和我們前期的實驗結(jié)果,推測ANXA1可能參與HPS相關(guān)的PASMCs炎癥表型和增殖的調(diào)控。同時由于HPS大鼠肺組織病理變化,以及結(jié)合既往的研究結(jié)果,課題組同時選擇和血管重構(gòu)及肺動脈高壓等疾病關(guān)系緊密的內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)進(jìn)行相關(guān)機制的進(jìn)一步探索,對ET-1的研究可能有助于進(jìn)一步完善ANXA1在HPS相關(guān)PVR的分子機制的研究。方法1.EXPAR反應(yīng)體系的建立和條件的優(yōu)化,通過55.0℃-65.0℃的溫度梯度,采用熒光定量方法(實時熒光EXPAR),探索EXPAR的適宜條件;制作SPR相關(guān)探針,處理SPR生物傳感器基質(zhì)膜芯片,并進(jìn)行探針的固定,通過傳感器實時檢測SPR角度,最終建立s EXPAR-SPR生物傳感器技術(shù);2.通過CBDL法建立在體HPS動物模型,根據(jù)通用標(biāo)準(zhǔn)判斷模型建立成功;利用s EXPAR-SPR生物傳感器技術(shù)檢測HPS大鼠肺組織中系列miRNA的表達(dá)變化;對于表達(dá)變化有統(tǒng)計學(xué)差異的結(jié)果,通過http://www.mirbase.org/網(wǎng)站進(jìn)行調(diào)控mRNA靶基因的預(yù)測;3.結(jié)合sEXPAR-SPR生物傳感器技術(shù)檢測結(jié)果和既往研究,選取ANXA1作為研究靶蛋白,應(yīng)用免疫組化和Western-blot法檢測HPS相關(guān)模型中ANXA1的表達(dá)變化;為完善ANXA1的相關(guān)研究,同時選取ET-1,檢測其在HPS相關(guān)模型中的表達(dá)變化;4.對ANXA1進(jìn)行干預(yù)作為可變因素,即利用腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)PASMCs中ANXA1蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,并采用RT-PCR、Western-blot法及免疫熒光等方法,檢測轉(zhuǎn)染效率;5.通過腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)ANXA1的表達(dá),同時再復(fù)合ET-1預(yù)處理,利用ELISA法檢測各組中IL-1β,TNF-α和IL-6的釋放;同時利用CCK-8、3H-TdR及Western-blot法檢測PASMCs的增殖情況及增殖相關(guān)蛋白p-ERK1/2和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的生成和表達(dá);6.利用RT-PCR和Western-blot法,檢測ET-I預(yù)處理的PASMCs細(xì)胞中ANXA1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平;利用ROS檢測技術(shù)檢測ET-1對PASMCs中ROS釋放的影響;7.利用免疫共沉淀技術(shù),檢測ANXA1和羰基化ANXA1的生成情況;復(fù)合應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG-132復(fù)合處理后,檢測各組ANXA1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.EXPAR反應(yīng)體系的建立,確定50℃為EXPAR的適宜條件;靶基因的濃度和EXPAR的曲線起跳時間及T50值呈線性相關(guān),當(dāng)濃度高時,曲線起跳早而T50值較低;當(dāng)濃度低時,曲線起跳晚而T50值較高,確定液相EXPAR檢測下限為100fM;目的基因和對照組進(jìn)行探針的制備和固定,目的基因流池曲線呈指數(shù)式升高,形成約500毫度的SPR角度變化,空白對照無明顯擴增反應(yīng)。s EXPAR-SPR生物傳感器實時在線檢測,當(dāng)待測DNA序列濃度為10-14M到10-8M時,T50與待測靶標(biāo)濃度的對數(shù)(lgC)呈線性相關(guān),最終sEXPAR-SPR生物傳感器技術(shù)構(gòu)建成功;2.sEXPAR-SPR生物傳感器檢測發(fā)現(xiàn)mi RNA-30a-5p在HPS組中T50值較對照組明顯縮短(P0.05),提示其在HPS組中表達(dá)上調(diào)。通過http://www.mirbase.org/網(wǎng)站預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其可以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控ANXA1;3.利用免疫組化和Western-blot法檢測發(fā)現(xiàn),HPS大鼠動物模型肺組織中ANXA1表達(dá)明顯下調(diào),ET-1表達(dá)明顯上調(diào);在PASMCs中ANXA1的表達(dá)隨ET-1的增加,呈劑量依賴性減少;4.利用免疫熒光、RT-PCR及Western-blot法檢測,AD-ANXA1腺病毒可以高效轉(zhuǎn)染PASMCs(轉(zhuǎn)染率90%),細(xì)胞生長良好,AD-ANXA1組其ANXA1的m RNA及蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);5.通過ELISA法檢測PASMCs中炎癥因子的釋放,AD-ANXA1轉(zhuǎn)染可以明顯抑制IL-1β,TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放;而ET-1預(yù)處理的PASMCs中炎癥因子釋放明顯增加;6.通過CCK-8和3H-TdR法檢測,AD-ANXA1轉(zhuǎn)染可以明顯抑制PASMCs的增殖;而ET-1預(yù)處理可以促進(jìn)PASMCs的增殖;7.通過Western-blot法檢測,AD-ANXA1轉(zhuǎn)染可以明顯抑制p-ERK1/2的生成和cyclin D1蛋白的表達(dá);加入刺激因素ET-1后,p-ERK1/2生成及cyclin D1蛋白的表達(dá)明顯上調(diào);8.RT-PCR及Western-blot法檢測,ET-1預(yù)處理的PASMCs中ANXA1的轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯,無論加或不加轉(zhuǎn)錄和翻譯抑制劑Act-D和CHX,其蛋白表達(dá)的減少都非常近似;9.ROS檢測發(fā)現(xiàn),ET-1預(yù)處理的PASMCs中ROS產(chǎn)生顯著增加;免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn),ET-1預(yù)處理的PASMCs中羰基化ANXA1明顯增加;10.利用蛋白酶體抑制劑MG-132復(fù)合處理后,ET-1誘導(dǎo)的ANXA1蛋白減少被明顯抑制。結(jié)論1.sEXPAR-SPR生物傳感器是一種高效、高通量的檢測技術(shù),待測基因的濃度和曲線起跳時間及T50值相關(guān),這一技術(shù)可以作為HPS相關(guān)研究的初篩工具;2.在HPS肺組織中,mi R-30a-5p表達(dá)明顯上調(diào),通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)其可以對ANXA1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,結(jié)合既往研究結(jié)果,推測ANXA1在HPS相關(guān)PVR中具有調(diào)控作用;3.在HPS相關(guān)模型中ANXA1和ET-1發(fā)生相應(yīng)變化,且在PASMCs中ANXA1的表達(dá)隨ET-1的增加,呈劑量依賴性減少。推測ET-1通過調(diào)控ANXA1的表達(dá)在HPS中發(fā)揮重要作用;4.利用腺病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)ANXA1的表達(dá)后,PASMCs中的炎癥因子釋放被顯著抑制,ET-1的增加可能刺激炎癥因子的釋放,其作用可能是通過下調(diào)ANXA1表達(dá)而實現(xiàn);5.AD-ANXA1轉(zhuǎn)染PASMCs后,其增殖明顯受抑,并且抑制p-ERK1/2的生成和從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核,同時抑制cyclin D1蛋白的表達(dá),而加入ET-1后可能刺激PASMCs的異常增殖和上調(diào)增殖相關(guān)蛋白的生成和表達(dá),其作用可能是通過下調(diào)ANXA1表達(dá)而實現(xiàn);6.ET-1不影響ANXA1的轉(zhuǎn)錄水平;其可能通過介導(dǎo)ROS的釋放,使ANXA1發(fā)生羰基化并穩(wěn)定性降低,發(fā)生了蛋白體酶相關(guān)的降解,最終導(dǎo)致ANXA1表達(dá)降低。通過以上結(jié)論提示,在HPS相關(guān)的PVR中,PASMCs發(fā)生炎癥表型并異常增殖;ANXA1在HPS大鼠肺組織中表達(dá)下調(diào),而ET-1表達(dá)上調(diào);ET-1可能通過介導(dǎo)ROS的釋放,使ANXA1發(fā)生羰基化并加劇降解,進(jìn)而逆轉(zhuǎn)ANXA1對PASMCs炎癥表型和增殖的抑制,最終促進(jìn)HPS相關(guān)PVR的進(jìn)一步發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R575;R563

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本文編號：1388291