本文關(guān)鍵詞：FAM83D上調(diào)CD44表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌干性及轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制研究　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景:原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的高致死率惡性腫瘤,也是我國最主要的公共健康問題之一。雖然目前在針對HCC的早期篩查、診斷、手術(shù)技術(shù)等方面取得了明顯進(jìn)步,并顯著延長了 HCC患者的生存時間和改善了生存質(zhì)量,但是HCC的高轉(zhuǎn)移率和術(shù)后高復(fù)發(fā)率始終限制著總體生存率的提高。如何有效防治術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為進(jìn)一步改善HCC患者生存預(yù)后的關(guān)鍵問題。基因組突變和重組是HCC獲得更強異質(zhì)性以及包含干細(xì)胞特性、高度耐藥性等惡性能力的原始動力,在增強HCC細(xì)胞生存能力中起重要作用。全面解讀HCC腫瘤基因組發(fā)生的突變、結(jié)構(gòu)異常、染色體重構(gòu)以及拷貝數(shù)變異等信息可為揭示HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究提供重要線索,并促進(jìn)早診分子標(biāo)記物與精準(zhǔn)治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。目的:本研究旨在借助高通量RNA測序技術(shù)對HCC組織和相應(yīng)的癌旁組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的解讀,尋找與HCC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵癌基因。擴(kuò)大樣本重點驗證候選癌基因FAM83D在HCC患者中的表達(dá)模式以及臨床意義。體外構(gòu)建FAM83D敲減細(xì)胞株,明確FAM83D在維持HCC細(xì)胞干性中的作用。最后,借助基因芯片和蛋白質(zhì)譜實驗闡明FAM83D調(diào)控HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制。材料與方法:1.通過高通量RNA測序和生物信息學(xué)分析篩選HCC組織與相應(yīng)癌旁組織間的差異表達(dá)基因。2.收集150對HCC患者腫瘤組織、配對癌旁組織以及臨床病理信息,利用免疫組織化學(xué)、實時熒光定量PCR等方法驗證候選基因FAM83D在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)模式,分析FAM83D在HCC組織中的表達(dá)水平與患者腫瘤病理參數(shù)、生存預(yù)后之間的相關(guān)性。3.通過體外轉(zhuǎn)染FAM83D-siRNA慢病毒構(gòu)建FAM83D敲減HCC細(xì)胞株,借助懸浮球細(xì)胞培養(yǎng)實驗、流式細(xì)胞儀表面蛋白表達(dá)量分析實驗、Western免疫印跡實驗檢測FAM83D對HCC細(xì)胞干性能力、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增的影響;利用裸鼠體內(nèi)成瘤實驗和細(xì)胞侵襲實驗觀察FAM83D對HCC細(xì)胞成瘤、轉(zhuǎn)移能力的影響。4.降低HCC細(xì)胞株FAM83D表達(dá)后,利用轉(zhuǎn)錄組基因芯片實驗進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選,通過GO和KEGG分析初步探索FAM83D參與HCC細(xì)胞干性調(diào)控的潛在分子機(jī)制。5.通過信號通路小分子抑制劑抑制實驗和CD44-siRNA轉(zhuǎn)染實驗驗證CD44與MAPK、TGF-β以及Hippo通路之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系,利用蛋白免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜分析明確FAM83D調(diào)控上述信號通路的關(guān)鍵上游分子。結(jié)果:1.通過對10對HCC樣本患者的高通量RNA測序,共篩選得到HCC組織及癌旁組織間差異表達(dá)基因544個(倍數(shù)改變2,P0.01),其中321個過表達(dá)基因,223個為低表達(dá)基因。FAM83D在9對HCC樣本中表達(dá)水平顯著增高,平均表達(dá)增高倍數(shù)超過8倍。2.在擴(kuò)大驗證的150對HCC樣本中,qRT-PCR和免疫組織化學(xué)實驗結(jié)果證實FAM83D在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于配對癌旁組織(P0.01)。高表達(dá)FAM83D與HCC患者惡性腫瘤生物學(xué)特征正相關(guān),如腫瘤低分化、血清高AFP水平、門靜脈侵犯、腫瘤數(shù)目3等。與FAM83D低表達(dá)組相比,FAM83D高表達(dá)患者擁有更高的肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率和更短的無瘤生存時間。3.體外細(xì)胞干性實驗證實HCC細(xì)胞株敲減FAM83D后,顯著抑制了 CD44s和CD44v分子的表達(dá)以及懸浮球形成能力。體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)FAM83D后可顯著抑制HCC細(xì)胞株的成瘤能力、腫瘤轉(zhuǎn)移能力以及肺克隆能力。4.轉(zhuǎn)錄組基因芯片結(jié)果提示FAM83D下調(diào)后可引起1565個基因出現(xiàn)差異表達(dá)(倍數(shù)2,P0.01),主要分布于MAPK、TGF-β以及Hippo等信號通路。敲減FAM83D表達(dá)后,ERK1/2、Smad2磷酸化水平下降,YAP表達(dá)水平受到抑制,YAP磷酸化水平相對增高。5.MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路抑制后,可顯著下調(diào)CD44分子的表達(dá);干擾CD44表達(dá)后,ERK1/2、Smad2磷酸化、YAP表達(dá)水平下降,YAP磷酸化水平相對增高,提示CD44與上述信號通路存在互相調(diào)節(jié)作用。6,6.蛋白免疫共沉淀實驗和質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)RAP1為FAM83D調(diào)控MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路的關(guān)鍵上游分子。結(jié)論:1.相對于癌旁組織,FAM83D在HCC組織的表達(dá)水平明顯升高,并與惡性腫瘤生物學(xué)行為和不良預(yù)后相關(guān)。2.敲減FAM83D可顯著抑制CD44分子的表達(dá)和HCC細(xì)胞株的干性、成瘤、轉(zhuǎn)移能力,提示FAM83D可能為HCC精準(zhǔn)治療的新靶標(biāo)。3.MAPK、TGF-β以及Hippo信號通路是FAM83D參與調(diào)控CD44分子表達(dá)和HCC發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制。
[Abstract]:BACKGROUND : Primary hepatocellular carcinoma ( HCC ) is one of the most common malignant tumors in HCC and is one of the most important public health problems in HCC . Conclusion : 1 . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo in HCC cell line decreased and the expression level of YAP decreased . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo signal pathway were significantly inhibited .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1384294